响应面法优化植酸酶水解大豆分离蛋白的工艺

张仁楠，姚 磊，富校轶，，*

(1.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030;2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030)

响应面法优化植酸酶水解大豆分离蛋白的工艺

张仁楠1，姚 磊2，富校轶1，2，*

(1.东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030;2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030)

以大豆分离蛋白为实验材料，在酶解温度、酶添加量、pH、水解时间等单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用四因素三水平响应曲面分析法，依据回归分析确定各工艺条件的主要影响因素，以大豆分离蛋白中植酸的去除率为响应值作响应面。植酸去除的最佳工艺条件为:反应温度44.87℃，酶添加量为8.24%，pH为5.54，反应时间为3.03h。在最佳工艺条件下，植酸的去除率为95.15%，验证实验结果为94.98%。

大豆分离蛋白，植酸，植酸酶，响应面

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白 购自哈工大;植酸酶 购自Sigma公司(小麦中提取，0.03U/mg);其它试剂 分析纯。

电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司; TU-1901双光速紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;Z36HK低温高速离心机 德国Hermle公司;高速离心机，PP-25E型酸度计，HH-8恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 植酸的测定 采用测铁分光光度法于500nm测定植酸的含量［10］。

1.2.2 影响植酸去除率的单因素实验 以植酸去除率为指标，分别选取水解温度，酶添加量，pH和水解时间进行植酸酶酶解大豆分离蛋白的单因素实验。

1.2.3 响应曲面法实验设计 采用Box-Behnken模型，以水解温度，酶添加量，pH和水解时间为主要考察因素。因素水平编码见表1。

表1 因素水平编码

2 结果与讨论

2.1 反应温度对植酸去除率的影响

取10mL离心管20支，(共五个温度点，每个温度点一个对照管三个实验管)。每管均加入待测样品0.1g左右，加入乙酸缓冲液4mL，分别在30、35、40、45、50、55℃恒温振荡水浴中温浴30min。

在上述实验管中分别加入酶溶液0.5mL，在旋涡混合仪上迅速混合后放入水浴锅中，在加酶后的1h，按与加入酶液相同的顺序加终止液硝酸(1+3)使酶失活。考察不同反应温度对植酸去除率的影响，结果见图1。

图1 温度对植酸去除率的影响

由图1可见，温度在30～45℃之间时，植酸的去除率随着温度的增加而增加。但当温度大于45℃时，植酸的去除率随温度的升高而下降。植酸酶的最适温度约为45℃，符合植物性植酸酶的最适温度(45～60℃)。所以，在下面的响应面实验设计中植酸酶水解温度选择40～50℃。

2.2 酶添加量对植酸去除率的影响

取10mL离心管20支，(共五个温度点，每个温度点一个对照管三个实验管)。每管均加入待测样品0.1g左右，加入乙酸缓冲液4mL，37℃恒温振荡水浴中温浴30min。

在上述实验管中分别加入 1.34%、2.68%、5.36%、8.04%、10.72%的酶液，在旋涡混合仪上迅速混合后放入水浴锅中，在加酶后的1h，按与加入酶液相同的顺序加终止液硝酸(1+3)使酶失活。考察不同酶添加量对植酸去除率的影响，结果见图2。

从图2可见，随着酶添加量的增加，植酸的去除率逐渐增加，酶添加量为8.04%时水解效果好。所以，在下面的响应面实验设计中植酸酶的添加量选择5.36%～10.72%。

2.3 pH对植酸去除率的影响

图2 酶添加量对植酸去除率的影响

取10mL离心管36支，(共九个pH点，每个pH点一个对照管三个实验管)。每管均加入待测样品0.1g左右，加入乙酸缓冲液4mL，调节pH，在37℃恒温振荡水浴中温浴30min。

在上述实验管中分别加入酶溶液0.5mL，在旋涡混合仪上迅速混合后放入水浴锅中，在加酶后的1h，按与加入酶液相同的顺序加终止液硝酸(1+3)使酶失活，考察不同pH对植酸去除率的影响。结果见图3。

图3 pH对植酸去除率的影响

由图3可见，pH 2.5～5.5时，植酸的去除率随pH增加而升高。pH为5.5时植酸的去除率达到最大值，效果最好。植酸酶的最适pH约为5.5，符合植物性植酸酶的最适pH 4～6。所以，在下面的响应面实验设计中植酸酶水解pH选择5.0～6.0。

2.4 反应时间对植酸去除率的影响

取10mL离心管28支，(共七个温度点，每个温度点一个对照管三个实验管)。每管均加入待测样品0.1g左右，加入乙酸缓冲液4mL，加入到37℃恒温振荡水浴中温浴30min。

在上述实验管中分别加入酶溶液0.5mL，在旋涡混合仪上迅速混合后放入水浴锅中，分别在加酶后的0.5、1、2、2.5、3、3.5、4h，按与加入酶液相同的顺序加终止液硝酸(1+3)使酶失活。考察不同反应时间对植酸去除率的影响，结果见图4。

图4 不同反应时间对植酸去除率的影响

从图4可见，水解时间小于3h时，植酸的去除率呈上升趋势，酶与底物反应需要一定的时间;之后植酸的去除率趋于不变，可见底物完全被水解。因此，水解时间为3h时效果最好。所以，在下面的响应面实验设计中植酸酶水解时间选择2.5～3.5h。

2.5 响应曲面法实验结果

2.5.1 模型建立 根据实验因素与水平的设计，采用不同的反应温度，酶添加量，pH和反应时间。进行29次实验。各因素安排及结果见表2。

表2 实验设计与结果

对表2在不同条件下所测得的植酸去除率，利用Design expert 7.1统计软件进行回归拟合，得到植酸去除率(Y)的回归方程:

2.5.2 模型方差分析 利用Design expert 7.1统计软件进行二次多元回归拟合，得到回归方程模型的方差分析和回归方程系数估计值，见表3。

回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则响应变量的显著性越高。由表3可知，四个因素的Prob＞F值相差较大，对提取结果的影响顺序为:酶添加量＞pH＞水解温度＞水解时间。从方差分析可以看出模型Prob＞F值小于0.01，表明该模型方程高度显著，不同处理间的差异高度显著。模型失拟项的Prob＞F值0.8833＞0.05，模型失拟项不显著，模型选择合适。由此可见，各具体实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。相关系数 R2=3082.37/3186.16= 0.967(大于0.8)，说明植酸去除率(Y)实际值与预测值之间具有较好的拟合度，因此该模型可用于预测响应值植酸去除率(Y)的实际情况。

表3 回归方程的方差分析

2.5.3 响应曲面分析与最优工艺条件的确定 根据回归分析结果，做出相应曲面图，如图5～图8所示。从相应曲面分析图上可以找到最佳参数及各参数之间的交互作用。

图5 酶添加量与温度的交互作用

图6 温度与pH的交互作用

图5～图8直观地反映了各因素对响应值的影响。比较4组图可知，水解时间、水解温度、酶添加量和pH对植酸的去除率影响均较为显著，表现为曲线较陡。

植酸去除率的响应面趋势呈抛物线形，因此回归方程有极大值，结合方程与响应曲面可得到植酸酶水解大豆分离蛋白中植酸的最优参数为:反应温度44.87℃，酶添加量为8.24%，pH为5.54，反应时间为3.03h，植酸的去除率为95.15%。

图7 酶解时间与酶添加量的交互作用

图8 水解时间与pH的交互作用

根据最佳工艺条件，做三组验证性实验，结果如表4所示。

表4 最佳工艺条件验证结果

由表4可以看出，在所得的最佳工艺条件下植酸的去除率与预测值接近，因此进一步验证了实验结果。

3 结论

通过单因素实验以及在此基础上通过四因素三水平响应面法实验，建立了响应值与各因素之间的数学模型，依此模型可以预算理论植酸去除率。用响应面分析法对植酸酶水解大豆分离蛋白的工艺参数进行优化，得到的回归方程为:

对植酸去除率影响较大的四个因素的Prob＞F值相差较大，对提取结果的影响顺序为:酶添加量＞pH＞水解温度＞水解时间。根据回归模型，确定植酸酶水解大豆分离蛋白的最佳工艺参数:反应温度为44.87℃，酶添加量为8.24%，pH为5.54，反应时间为3.03h，在此条件下，植酸的去除率为95.15%，验证实验结果为94.98%。

［1］金瑛，马冠生.食品中植酸的分布、含量及其影响因素［J］.国外医学卫生学分册，2005，32(3):133-136.

［2］吴道银.大豆中抗营养因子简介［J］.四川粮油科技，2003 (1):51-52.

［3］王春林，陈喜斌，等.大豆中抗营养因子及其处理方法［J］.饲料工业，1998(11):1-8.

［4］吴新民，丁巧丽.豆粕中抗营养因子及抗营养机理的研究进展［J］.浙江畜牧兽医，2004(1):37.

［5］李平兰，江汉湖.饲料研究［J］.动物营养学报，1999(4):1.

［6］Frank Liebert，Leandro Portz.Different sources of microbial phytase in plant based low phosphorusdiets for Nile tilapia Oreochromis niloticus may provide differenteffects on phytate degradation［J］.Science Direct，2007(6):296-299.

［7］Peter H Selle，Aaron J Cowieson，V Ravindran.Consequences of calcium interactions with phytate and phytase for poultry and pigs［J］.Livestock Science，2009(6):16.

［8］Jianfen Liang，Bei-Zhong Han，M J Robert Nout，et al.Effect of soaking and phytase treatment on phytic acid，calcium，iron and zinc in rice fractions［J］.Food Chemistry，2009，115:789-794.

［9］周虓，郑毅，叶海梅，等.响应面分析法优化耐高温蛋白酶发酵培养基［J］.生物数学学报，2007，26(3):33-37.

［10］刘坤，高华，张东峰.不同植酸测定方法的对比分析［J］.青岛医学院学报，1997，33(3):191-192.

Optimization of phytase hydrolysis of soybean protein isolated by response surface methodology

ZHANG Ren-nan1，YAO Lei2，FU Xiao-yi1，2，*
(1.Northeast Agricultural University，College of Food Science，Harbin150030，China; 2.The National Research Center of Soybean Engineering and Technology，Harbin 150030，China)

With soybean protein isolated as experiment material，on the base of single factor experiments(hydrolysis time，hydrolysis temperature and so on)，then through the experimental design of response surface methodology with four factors and three levels based on the principle of Box-Behnken design，the conditions of hydrolysis were studied.The optimal hydrolysis conditions:hydrolysis temperature was 44.87℃，exterior phytase addition about 8.24%，pH was 5.54，hydrolysis time was 3.03h.Experiments that checked the optimal hydrolysis time conditions showed that phytate of soybean protein isolated was degraded about 95.15%，proof test result was 94.98%.

soybean protein isolated;phytate;phytase;response surface methodology

TS201.2+1

B

1002-0306(2011)11-0292-04

植酸，化学名环乙六醇六磷酸酯(IP6)，广泛存在于谷类、水果、蔬菜和干果等植物性食物中［1］。大豆中60%～80%的磷都是以植酸态的形式存在的，大豆中的植酸含量可达2%。植酸是一种很强的络合剂，其12个酸基在肠胃中能牢固地络合带正电荷的Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+等二价和多价金属离子，形成难溶性的植酸盐络合物，从而影响这些元素的吸收。另外，植酸还能与大豆蛋白或一些酶结合，形成植酸蛋白质复合物，影响蛋白质的生理功能［2-5］，降低食品的营养价值。植酸酶是一种特殊的酸性磷酸酶［6］，能催化水解植酸植酸盐向正磷酸盐及其他磷酸肌醇中间产物转化，从而释放出磷酸根离子［7］，把原来无法利用的磷变为有效磷而被动物吸收利用，间接地起到补充磷的作用［8］。关于谷物中植酸去除的研究不少，但方法不一，效果也不尽相同［9］。本实验将响应曲面法(response surface methodology，RSM)应用于植酸酶去除大豆分离蛋白中植酸工艺的优化，以期获得最优的工艺参数，从而改善植酸去除的效果，为大豆产品的开发利用奠定基础。

2010-09-07 *通讯联系人

张仁楠(1987-)，女，硕士，主要从事粮食、油脂与农产品加工及储藏方面的研究工作。

国家“863”计划项目(2006AA10Z332);黑龙江省青年基金项目(41400075-6-08003)。