阿魏侧耳多糖抗癌作用机理研究△

王金辉，黄健， 巩平， 李国玉， 魏秀岩， 秦颖， 张翠， 杨琳， 王莹

(1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832002;2.沈阳药科大学中药学院，沈阳辽宁 110016;3.教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室，新疆 石河子 832002)

药理研究

阿魏侧耳多糖抗癌作用机理研究△

王金辉1，2，3，*，黄健2*， 巩平1， 李国玉1， 魏秀岩2， 秦颖2， 张翠2， 杨琳1， 王莹1

(1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832002;2.沈阳药科大学中药学院，沈阳辽宁 110016;3.教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室，新疆 石河子 832002)

目的:阿魏侧耳 (阿魏菇)多糖(Pleurotus ferulae polysaccharide，PFP)抗宫颈癌作用的机理研究。方法:MTT法、中性红比色法和Griess法。结果:灌胃给药500 mg·kg-1的阿魏菇多糖可抑制小鼠宫颈癌U14移植瘤的生长，抑瘤率达到39%，临床抗宫颈癌药顺铂的抑瘤率为46.5%，阿魏菇多糖与顺铂共同作用时，抑瘤率达到65.1%;但是在体外实验中，不同浓度阿魏菇多糖分别作用于人宫颈癌HeLa和人乳腺癌MCF-7细胞不同时间后，却不能抑制两种细胞的生长;在5μg·mL-1的脂多糖刺激下，阿魏菇多糖不能促进脾淋巴细胞的增殖;不同浓度的阿魏菇多糖作用于腹腔巨噬细胞24 h，能使腹腔巨噬细胞的吞噬能力显著增强，并且呈现明显的剂量依赖性，与此同时阿魏菇多糖也促进了腹腔巨噬细胞的增殖，但是却不能刺激腹腔巨噬细胞释放NO。结论阿魏菇的抗宫颈癌机制可能是通过促进小鼠机体免疫功能而实现的。

阿魏菇多糖;U14荷瘤小鼠;腹腔巨噬细胞;脾淋巴细胞

阿魏侧耳Pleurotus ferulaeLanzi，又名阿魏菇，阿魏蘑，因其生长在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子实体菌肉肥厚、味道鲜美、口感柔润，具有很高的营养价值和药用价值[1]。阿魏侧耳中含有多种营养物质，如含有多种维生素、氨基酸、蛋白质、不饱和脂肪酸和微量元素，其中蛋白质的含量可高达子实体干重的20%[2，3]。除此之外，阿魏侧耳中所含的多糖据报道是其中的生物活性成分，具有抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化和抗衰老等功效[4]。本文对阿魏侧耳多糖的抗宫颈癌的活性进行了测试，并对其抗癌的作用机理进行了初步的研究。

1 材料

1.1 动物

健康昆明系小鼠，6～8周龄，雄性，体重18～22 g，购自新疆大学医学院实验动物中心。动物随机分组后置于温度20～24℃，恒湿(55±5)%，12 h光照(8∶00 ～20∶00)、 12 h 黑暗、 隔音的动物室内，自由摄食、饮水。

1.2 瘤细胞株

小鼠宫颈癌U14细胞株，小鼠腹腔传代，购自北京金紫晶生物医药技术有限公司。实验时，当传代的小鼠腹水变白时，采集腹水并用0.9%的氯化钠溶液稀释成1×107·mL-1的瘤细胞悬液备用。

1.3 主要试剂及仪器

顺铂(Diaminodichloroplatin，DDP，齐鲁制药有限公司，批号:9120532DC);RPMI 1640培养液，脂多糖(LPS)，小鼠淋巴细胞分层液，DMSO，四甲基偶氮唑盐(MTT)，灭活小牛血清，PBS缓冲液，均为Sigma公司产品;DMEM培养液(GIBCO公司);MTT以pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配成5 mg·mL-1备用。Griess试剂以蒸馏水配制0.1%盐酸萘乙二胺(Sigma产品)，5%磷酸配制1%磺胺嘧啶(Sigma产品)，临用前两者等量混合。美国BIORAD伯乐酶标仪(680)由沈阳药科大学提供。

1.4 试药

阿魏菇购于新疆石河子市，经石河子大学谭勇博士鉴定为阿魏侧耳PleurotusferulaeLanzi，标本号为No.20071002001，保存在石河子大学药学院。

阿魏菇加水热提取1次，浸提温度70℃，浸提2 h，料液比1∶40。阿魏菇水提取物加入木瓜蛋白酶(酶底比8 mg·g-1)，用HCl分别调pH为6，60℃水浴90 min水解后，沸水浴10 min使酶灭活，冷却至室温，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液加95%乙醇至醇浓度80%，3 000 r·min-1离心10 min取沉淀，得阿魏菇多糖，得率3.1%。

2 方法

2.1 阿魏侧耳多糖对U14荷瘤小鼠的抑瘤率

小鼠32只均于右腋下接种107·mL-1浓度的U14小鼠宫颈癌细胞悬液0.2 mL，随机分为4组，每组8只，待瘤长至米粒大小后开始分组给药，模型组隔天腹腔注射无菌0.9%氯化钠溶液(NS)0.2 mL/只，顺铂组隔天腹腔注射3 mg·kg-1的顺铂0.2 mL/只，阿魏侧耳组每天用500 mg·kg-1阿魏侧耳多糖0.2 mL/只灌胃，阿魏侧耳+顺铂组每天用500 mg·kg-1的阿魏侧耳多糖0.2 mL/只灌胃，隔天腹腔注射3 mg·kg-1的顺铂0.2 mL/只，连续10 d。所有小鼠初始体重，于第11天处死小鼠，称重，剥取瘤块，洗去血渍，用吸水纸吸干水分，称重。

抑瘤率(%)=对照组(NS)平均瘤重-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重×100%

2.2 人宫颈癌HeLa和人乳腺癌MCF-7细胞生长实验

人宫颈癌HeLa和人乳腺癌MCF-7细胞，用培养液RPMI 1640混悬细胞至浓度4×105个·mL-1，分别接种于96孔培养板，每孔100μL。培养12 h，分别加入不同浓度的阿魏侧耳多糖，培养24 h后，MTT法测定两种细胞生长率，酶标仪570 nm测A值。

细胞生 长 率 (%) = [A570(给药)-A570(空白)]/[A570(阴性)-A570(空白)] ×100

2.3 小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验

无菌取小鼠脾脏，按常规制备脾细胞悬液，最后用DMEM培养液调细胞浓度至1×106·mL-1。取上述细胞悬液加入96孔板中，每孔100μL，同时设空白对照组、阴性对照组及LPS对照组。空白对照组及阴性对照组加DMEM培养液培养，除空白对照组及阴性对照组外，各组分别加入LPS至终浓度为5μg·mL-1，其他给药组分别加入阿魏侧耳多糖至终浓度为 3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1。用MTT法检测细胞的增殖率，酶标仪570 nm测A值。

细胞增殖率(%) = [A570(LPS或给药)-A570(空白)]/[A570(阴性)-A570(空白)] ×100

2.4 腹腔Mφ吞噬功能测定(中性红比色法)

用冷PBS注入小鼠腹腔，常规制备腹腔Mφ悬液。用完全DMEM培养液调细胞浓度至1×106·mL-1，加入96孔板，每孔100μL，置37℃，5%CO2培养箱内培养4 h后，弃未黏附细胞，同时设空白对照组、阴性对照组。空白对照组及阴性对照组加DMEM培养液培养，其他给药组分别加入阿魏侧耳多糖至终浓度为3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1， 置37℃，5%CO2培养箱内培养24 h后，弃上清液，加入0.072%的中性红溶液100μL/孔，培养30 min后，以PBS洗2次，加入腹腔Mφ裂解液200μL/孔，4℃静置过夜，酶标仪530 nm测A值。

2.5 腹腔MφNO释放能力测定(Griess法)

腹腔Mφ制备、加样、分组同上。经37℃，5%CO2培养24 h，取上清液100μL加至另一块96孔板相应位置，加入Griess液100μL/孔，25℃反应10 min，酶标仪530 nm测A值。

分析两组行口腔修复患者的临床治疗效果、口腔舒适度、患者满意度、口腔修复体匹配程度、生活质量。行口腔修复患者临床总有效率的评价标准。显效:口腔修复体与牙龈接触良好。有效:口腔修复体与牙龈边缘接触一般。无效:口腔修复体与牙龈边缘接触较差。治疗总有效率=显效率+有效率。患者满意度采用本院自制量表进行评价,总分100分,非常满意:总评分≥85分;一般:总评分70-85分;不满意:总评分<70分。患者满意度=非常满意+一般。生活质量采用SF-36量表进行评价,患者得分越高,生活质量越高[3]。

2.6 小鼠腹腔巨噬细胞增殖实验

用冷PBS注入小鼠腹腔，常规制备腹腔Mφ悬液，用DMEM培养液调细胞浓度至1×106·mL-1。其余操作同2.3。

2.7 统计方法

各组数据采用组间方差分析和t检验统计处理。

3 结果

3.1 阿魏侧耳多糖对宫颈癌U14荷瘤鼠生长的影响

图1结果显示，500 mg·kg-1的阿魏侧耳多糖抑瘤率达到39%，表明其具有很强的抑制小鼠宫颈癌U14移植瘤生长的作用;临床抗宫颈癌药顺铂的抑瘤率为46.5%;阿魏侧耳多糖与临床抗宫颈癌药顺铂共同作用时，抑瘤率达到65.1%，说明阿魏侧耳多糖可以提高顺铂的抗癌疗效。

图1 阿魏侧耳多糖对U14荷瘤鼠生长影响图

3.2 阿魏侧耳多糖对人宫颈癌HeLa和人乳腺癌MCF-7细胞生长的影响

不同浓度阿魏侧耳多糖3，6，12，25，50，100 μg·mL-1分别作用于人宫颈癌 HeLa和人乳腺癌MCF-7细胞12，24，36 h后的结果如图2，3所示，对两种细胞的生长情况几乎没产生影响(无统计学意义)。显微镜下观察细胞的形态，发现细胞分布均匀，自然舒展且细胞壁完整(如图4，5所示)。以上实验表明阿魏侧耳多糖在体外对肿瘤细胞生长没有直接抑制作用。

图2 MTT法测定阿魏侧耳多糖对人宫颈癌HeLa细胞的生长影响图(n=3,s)

图3 MTT法测定阿魏侧耳多糖对人乳腺癌MCF-7细胞的生长影响图(n=3,xs)

图4 阿魏侧耳多糖处理人宫颈癌HeLa细胞24 h的细胞形态图

图5 阿魏侧耳多糖处理人乳腺癌MCF-7细胞24 h的细胞形态图

3.3 阿魏侧耳多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

5μg·mL-1的LPS单独作用脾淋巴细胞24 h，促进了脾淋巴细胞的增殖，与DMEM培养的阴性对照组(100%)相比，细胞的增殖率为135%。但是不同浓度的阿魏侧耳多糖和LPS共同作用组与LPS单独作用组相比，无统计学意义，本实验结果表明阿魏侧耳多糖对LPS没有协同增殖作用，如图6所示。

图6 MTT法测定阿魏侧耳多糖对脾淋巴细胞的增殖影响图(n=3,x±s)

3.4 阿魏侧耳多糖对腹腔Mφ吞噬功能及NO释放的影响

阿魏侧耳多糖 3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1作用于腹腔Mφ24 h，能使腹腔Mφ的吞噬能力显著增强并且呈现明显的剂量依赖性，如图7所示。但是不同浓度的阿魏侧耳多糖作用于腹腔巨噬细胞，与阴性对照组(阿魏侧耳多糖0μg·mL-1)相比，阿魏侧耳多糖不能刺激腹腔巨噬细胞释放NO(无统计学意义)，如图8所示。

图7 阿魏侧耳多糖对小鼠巨噬细胞吞噬的影响图(n=3,x±s)

3.5 阿魏侧耳多糖对腹腔Mφ增殖的影响

3， 6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1的阿魏侧耳多糖作用于腹腔Mφ24 h，能促进腹腔Mφ的增殖。其中25μg·mL-1阿魏侧耳多糖作用于腹腔Mφ与阴性对照组(0μg·mL-1)相比，能显著促进细胞的增殖，如图9所示。

图8 阿魏侧耳多糖对小鼠巨噬细胞释放NO的影响图(n=3,xs)

图9 M TT法测定阿魏侧耳多糖对腹腔Mφ细胞的增殖影响(n=3,x±s)

4 讨论

作为一种珍稀的药食两用资源，阿魏侧耳的抗肿瘤方面的研究已有一些报道[5]。本实验选用了文献中阿魏侧耳多糖的最适剂量500 mg·kg-1，结果表明，阿魏侧耳多糖对小鼠宫颈癌U14移植瘤有一定的抑制效果，抑瘤率达到39%，临床常用的宫颈癌化疗一线药顺铂对其的抑瘤率为46.5%，阿魏侧耳多糖与顺铂共同作用时，抑瘤率达到65.1%，说明阿魏侧耳多糖可以提高顺铂的抗癌疗效。但是，不同浓度阿魏侧耳多糖分别作用于人宫颈癌HeLa和人乳腺癌MCF-7细胞不同时间后，对两种细胞的生长情况几乎没产生影响，表明阿魏侧耳多糖在体外对肿瘤细胞生长没有直接抑制作用。

阿魏侧耳的抗癌机制可能是通过其免疫激活作用实现的。它可激活机体免疫系统的细胞和体液免疫应答而发挥抗肿瘤作用，尤其是细胞免疫的激活及其产生的细胞因子具有重要的作用。巨噬细胞是参与杀伤肿瘤的一种十分活跃的免疫效应细胞，Mφ主要通过内吞和分泌一些效应分子NO等杀伤肿瘤细胞[6]。本文实验结果表明，阿魏侧耳多糖3，6， 12， 25， 50， 100 μg·mL-1作用于腹腔Mφ24 h，能使腹腔Mφ的吞噬能力显著增强，并且呈现明显的剂量依赖性。但是3，6，12，25，50，100μg·mL-1阿魏侧耳多糖作用于腹腔巨噬细胞，与阴性对照组(阿魏侧耳多糖0μg·mL-1)相比，阿魏侧耳多糖不能刺激腹腔巨噬细胞释放NO。同时我们也考察了相同浓度的阿魏侧耳多糖对腹腔巨噬细胞增殖能力的影响，阿魏侧耳多糖作用于腹腔Mφ24 h，能促进腹腔Mφ的增殖，其中25μg·mL-1阿魏侧耳多糖作用于腹腔Mφ与阴性对照组(0μg·m L-1)相比，能显著促进细胞的增殖。

淋巴细胞包括B淋巴细胞和T淋巴细胞，并且两种细胞在脾脏中大量分布。T细胞在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用，其作为免疫效应细胞，主要有两方面功能:介导迟发型超敏反应和直接杀伤靶细胞。B细胞通过分泌的抗体行使其免疫功能，另外活化的B细胞还具有加工和提呈抗原给T细胞的作用[7]。淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。本文实验结果表明，5μg·mL-1的LPS单独作用脾淋巴细胞，促进了脾淋巴细胞的增殖，但是阿魏侧耳多糖在LPS的刺激下，没能促进脾淋巴细胞的增殖。

综合以上实验结果，在体内阿魏侧耳多糖抑制了小鼠宫颈癌U14荷瘤增殖，然而在体外阿魏侧耳多糖却不能抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长，但是阿魏侧耳多糖促进了小鼠腹腔巨噬细胞的增殖和吞噬功能。实验结果表明，阿魏侧耳的抗癌机制可能是通过促进小鼠机体免疫功能而实现的。

[1]宋旭红，张月明，刘金宝，等.阿魏蘑菇提取物对肿瘤细胞p53表达的影响[J].中国公共卫生，2003，19(6):690-691.

[2]李永泉，吴炬，杨全珍，等.白阿魏侧耳深层发酵工艺的研究[J].西北民族大学学报，2003，24(4):14-18.

[3]张桂芝，杜鹃，付雪燕，等.阿魏侧耳中多酚氧化酶特性及其抗褐变剂的研究[J].新疆农业大学学报，2004，27(1):73-76.

[4]黄年来.中国食用菌百科[M].北京:中国农业出版社，1993:114-115.

[5]宋旭红，张月明，刘金宝，等.新疆阿魏侧耳粗提物抗肿瘤效应研究[J].营养学报，2004，26(2):127-130.

[6]Liew FY，Lox FEG.Nonspecific defencemechanism:the role of nitric oxide[J].Immunol Today， 1991， 12(3):17-21.

[7]Perez VL， Lederer JA， Lichtman AH， et al.Medical Immunology[M].Beijing:The People′s Hygeian Publis-hing Company，2000:85-93.

Study on the Mechanism s of Anti-tumor Effect of Pleurotus Ferulae Polysaccharide

WANG Jin-hui1，2，3，HUANG Jian2，GONG Ping1，LI Guo-yu1，WEI Xiu-yan2，QIN Ying2，ZHANG Cui2，YANG Lin1，WANG Ying1
(1.School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi832002，China;2.bSchool of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，China;3.KeyLaboratory of Phytomedicine Resources&Modernization of TCM，Shihezi832002，China)

Objective:To investigate the mechanisms of anti-tumor effect ofPleurotusferulaepolysaccharide(PFP)on cervix.Methods:MTT assay， neutral red colorimetry and Griess assay were used.Results:500mg·kg-1PFP(i.g.)can restrain growth of transplantation tumor U14 of cancer of the cervix(CACX)in Kunming mice and the inhibition rate was 39%.In combination PFPwith Diaminodichloroplatin，the inhibition rate against CACX U14 was 65.1%，compared with the inhibition rate of 46.5%in Diaminodichloroplatin-treated alone group.However， after treated HeLa and MCF-7 with different concentrations of PFP for different time periods， respectively，the PFP can not inhibit cell growth of the two kinds，in vitro.In the presence of 5μg·mL-1LPS， the PFP can not induce proliferation of splenic lymphocyte.Wherever，when the peritoneal macrophages were cultured with different concentrations of PFP for 24 h，the PFP was found to significantly increase the phagocytosis in a concentration dependent manner and trigger the proliferation of peritoneal macrophages， however， NO could not be detected in the same peritoneal macrophages.Conclusion:The PFP inhibited the CACX growth bymeans of improving the immune system in Kunmingmice.

Pleurotusferulaepolysaccharide(PFP);U14 tumor-bearing mice;Peritoneal macrophages;Splenic lymphocytes

国家863计划项目(2008AA10323)

*王金辉，Tel:(0993)2055001，E-mail:wangjh1972@vip.sina.cn;*黄健，Tel:(024)23986482，E-mail:huang-jian1977@yahoo.com.cn

2010-09-06)