猪传染性胃肠炎病毒Sa 基因的克隆与序列分析

温海燕 （菏泽学院动物科学系 山东 菏泽 274015）



猪传染性胃肠炎病毒Sa 基因的克隆与序列分析

温海燕 （菏泽学院动物科学系 山东 菏泽 274015）

将猪传染性胃肠炎病毒接种ST细胞进行增殖，待细胞出现明显的病变后，将细胞反复冻融3次收获病毒。根据GenBank中已发表的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列，设计合成了1对扩增S基因包含A抗原位点724bp基因片段(Sa)的引物，引物两端分别有HⅠ和dⅢ的酶切位点。以感染细胞提取的病毒RNA为模板，经RT-PCR扩增得到目的片段，然后将其克隆到pMD18-T载体上，经蓝白斑筛选和酶切鉴定选择阳性克隆进行序列测定，构建成功的重组质粒命名为pMD18-T-Sa。用DNAstar软件将其与GenBank上的序列进行同源性比较，结果表明，核苷酸同源性为97%以上，氨基酸同源性为93%以上。根据猪传染性胃肠炎病毒Sa基因核苷酸序列绘制的系统进化树，结果表明，试验株与TH-98株亲缘性最近。

胃肠炎病毒 Sa基因 克隆 序列分析

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)隶属于冠状病毒科冠状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原，由其引起的猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是一种急性、高度接触性肠道传染病，是世界动物卫生组织(OIE)法典中B类疫病中必检的猪传染病。不同年龄和品种的猪均易感，尤其以仔猪最易感，2周龄以内的仔猪致死率高达100%，以呕吐、腹泻、脱水、高死亡率为典型症状，成年猪死亡率较低，但是会造成机体消瘦，降低饲料利用率等[1]。目前该病已遍布全世界各国，给养猪业造成了巨大的经济损失。

TGEV由4种结构蛋白和3种非结构蛋白构成，其中S蛋白为大的糖蛋白，形成病毒突起，携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶受体(PAPN)的识别位点，在决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用[2]。S基因长度为4.35×103bp，包括A、B、C、D4个位点，其中A位点又可分为Aa、Ab、Ac 3种亚位点，A位点暴露于病毒的表面，主要诱导中和抗体的产生，并且不同分离株的A位点保守性强[3,4]。

目前国际上已培育多种弱毒疫苗，有德国的BI-30疫苗株，匈牙利的CKP弱毒株，美国的TGE-Vac株等等，国内哈尔滨兽医研究所也培育成功华株弱毒疫苗[5]。弱毒株大多是经不同方式的人工致弱而成，一般的弱毒疫苗均有一定的残余毒力与致病性，在动物体内增殖诱发免疫力的同时又有毒力返强的可能。而灭活疫苗接种后虽能诱导机体产生比弱毒疫苗更高的循环抗体，但因机体缺乏局部的黏膜免疫，不能有效地抵抗外界野毒的侵袭[6]。鉴于此，本研究对猪传染性胃肠炎病毒Sa基因进行克隆与序列分析，为猪传染性胃肠炎病毒新型基因工程疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 1640培养基(购自美国HyClone公司)，新生牛血清购自上海华美公司、Taq DNA聚合酶、TAKARADNA Fragment Purification Kit 、DNA 分子量标准 DL2000、限制性内切酶HⅠ和dⅢ、T4DNA 连接酶、胶回收纯化试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，X-gal、IPTG购自Merk 公司、DEPC购自Sigma公司、胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司，ST细胞、DH5α、猪传染性胃肠炎病毒均有传染病实验室保存，pMD18-T Vector购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 引物的设计与合成 根据GenBank中已发表的基因序列，应用Primer5.0软件自行设计合成了一对能扩增724bp基因片段(包括S基因A抗原位点)的引物，两端分别含有HⅠ和dⅢ的酶切位点及保护性碱基，序列：P1：5’ACGTCA TTG AAC ACA ACG GGT GGT GTC 3’HⅠ；P2：5’ AGCCTG TGG CAT CTA AAA CGT CCG T3’dⅢ。送北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.3 病毒RNA的抽提 将病毒液接种到ST单层细胞上，72h后，待细胞出现明显的细胞病变，将细胞反复冻融三次。10000rpm离心10min，取上清，获得的病毒液参照Trizol(一步法总RNA提取试剂)试剂盒说明书进行操作。

1.4 RT-PCR （1）cDNA的合成参照M-MLV Reverse Transcriptase 说明按下列体系进行反转录：RNA模板1μl，0.5μl下游引物P2，9μl RNase Free H2O，70℃温浴5min结束后立即放在冰上。继续添加4μl 5×M-MLV RTase buffer，2μl 100Mmdtt，2μl dNTP(2.5mM)，0.5μl RNase inhibitor，1μl M-MLV RTase，37-42℃温浴1h，得到的反应液可立刻用于PCR反应或－20℃保存备用。（2）Sa基因的PCR扩增。按常规方法进行PCR反应，冰上操作，采用25μl体系，PCR 管中依次加入以下试剂：3μl cDNA模板，2.5μ1 0×PCR Buffer，0.5μl上游引物P1(20pmoL/μl)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，18.75μl ddH2O，优化后的PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 1min、69.4℃ 1min、72℃ 1min进行30个循环，72℃10min。PCR结束后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。

1.5 目的片段的回收、纯化及序列测定 参照超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收纯化目的片段，然后将其与pMD18-T载体连接，将连接产物转化感受态细胞DH5α，挑斑，扩大培养，抽提重组质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，将鉴定为阳性克隆的菌液送宝生物(大连)有限公司测序。

1.6基因序列分析 利用DNAstar 软件对所测定的基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行编辑，并与GenBank中的序列进行同源性比较，然后用ProtScale软件对编码的Sa蛋白的空间进行模拟分析。

2 结果与分析

2.1 TGEV Sa基因的RT-PCR扩增 以TGEV RNA为模板，应用引物P2，反转录合成第一链cDNA，以P1和P2为引物扩增Sa基因，所获得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上呈单一条带，大小与预期724bp相符(图1)。

2.2 质粒的双酶切鉴定 重组质粒经HⅠ和dⅢ双酶切后，得到约760bp的插入片段和约2656bp的载体片带，证明所挑取的克隆为正确的重组转化子，将得到的重组质粒命名为pMD18-T-Sa(图2)。

2.3 重组质粒的PCR鉴定 将重组质粒pMD18-T-Sa转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得大量转化子。从中随机挑选几个重组子单菌落，用PCR方法进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，以引物P1和P2扩增出了大小为724bp的特异片段，表明所检测的克隆中均含有外源目的片段的插入(图3)。

图1 RT-PCR扩增结果

M：DNA标准DL2000；1-2：RT-PCR扩增产物

图2 重组质粒pMD18-T-Sa双酶切鉴定结果

M：DNA标准DL2000；1-2：双酶切鉴定结果

图3 重组质粒pMD18-T-Sa PCR鉴定

M：DNA标准DL2000；1-2：重组质粒pMD18-T-Sa PCR 鉴定

2.4 Sa基因的序列测定及分析 将疑似阳性克隆的菌液送宝生物(大连)公司进行测序，用DNAstar软件将测定序列与GenBank中的序列进行同源性比较，结果表明：试验株Sa基因与GenBank中毒株TH-98、HN2002、SC-Y、133、TS的基因核苷酸同源性分别为99.3%、97.9%、99.6%、97.7%、97.9%，氨基酸同源性分别为97.9%、95.0%、98.8%、93.8%、95.0% (表1)，再根据它们的核苷酸序列绘制系统进化树(图4)，结果表明：试验株与TH-98毒株在进化上亲缘关系最近，最后利用DNAstar软件对Sa片断的抗原表位进行分析，由图可见第178-231(即S基因A位点)位点抗原性好(图5)。

表1 不同病毒株Sa基因的核苷酸及氨基酸同源性比较(%)

注：*表示同源性为100%

3 讨论

（1）猪传染性胃肠炎病毒感染具有明显的肠嗜性，病毒粒子表面的纤突蛋白(S蛋白)与存在于肠上皮细胞顶膜的氨基肽酶(APN)的结合是感染发生的首要条件，因此，S蛋白是免疫预防和诊断研究的重点。TGEV只有1个血清型，而变异却使TGEV各毒株之间产生了抗原差异。彭树英等[7]将TSX毒株S全基因序列与其他毒株相比，虽在核酸和氨基酸序列上存在一定差异，但形成4个抗原位点的核酸和氨基酸序列并未发生变异，Aa、Ab、Ac位点仍高度保守，并且A位点的缺失可导致S蛋白丧失产生中和抗体的能力。因此，本研究设计引物扩增了一段包含TGEV S基因A位点的片段，为猪传染性胃肠炎基因工程疫苗的研制奠定了良好基础。（2）TGEV病毒通过消化道进入仔猪体内，其靶细胞都是肠绒毛上皮细胞，引起肠绒毛的萎缩脱落，导致动物消化紊乱、酸中毒和脱水。在预防上，如果在肠腔内经常有抗体存在，就可以不断中和猪体摄入的病毒，从而起到保护作用。因此，黏膜免疫是本病特异性免疫应答的主要特征，而肠道黏膜表面SIgA含量的高低直接决定临床疾病的发生和疾病严重程度[8]。针对本病的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生SIgA，尤其适应于肠道黏膜传染病，而探索安全、有效、廉价、可以诱导黏膜免疫产生的新型疫苗显得尤为重要。本试验成功地克隆得到了TGEV Sa基因，结合枯草芽孢杆菌基因的功能特点，构建新的跨膜体系，为研制有效诱导黏膜免疫产生的新型疫苗奠定基础。

图4 根据猪传染性胃肠炎病毒不同毒株Sa基因核苷酸序列绘制的系统进化树

图5 利用DNAstar软件对TGEV Sa片断的抗原表位分析

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（2011–02–26）

S852.65+9.4

A

1007-1733(2011)04-0001-03