大孔吸附树脂法富集纯化穿山龙总皂苷工艺研究

张园园，刘瑞，任睿，莫愁

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.广东省药品检验所，广东 广州 510000)

工 艺

*张园园，E-mail：choenen@yahoo.com.cn

大孔吸附树脂法富集纯化穿山龙总皂苷工艺研究

张园园1*，刘瑞1，任睿2，莫愁1

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102；2.广东省药品检验所，广东 广州 510000)

目的探讨大孔吸附树脂法富集纯化穿山龙总皂苷的工艺。方法以洗脱所得总固物的量及总固物中穿山龙总皂苷的含量为考察指标，考察树脂型号、洗脱溶剂用量等工艺条件与药材-树脂比例、色谱柱径高比、洗脱流速、收集洗脱液的量等工艺参数。结果最佳工艺为药材-树脂(1∶2)，色谱柱径高比1∶13，收集8 BV洗脱液的量。总固物得率为5.79 %～6.27 %，穿山龙总皂苷的含量为55.08 %～57.79 %。结论方法操作简单、安全、稳定，适合广泛应用推广。

穿山龙；总皂苷；制备工艺

穿山龙为穿龙薯蓣(DioscoreanipponicaMakino的根茎，收载于《中国药典》，具有祛风除湿，舒筋通络，活血止痛，止咳平喘的功能。用于风湿痹病，关节肿胀，疼痛麻木，跌扑损伤，闪腰岔气，咳嗽气喘[1]。穿山龙主要含有薯蓣皂苷等多种甾体皂苷类成分，甾体总皂苷为该药材防治心血管疾病等药理活性的主要成分[2]，因此寻找一种高效、实用的提取工艺是将总皂苷作为穿山龙有效部位研究开发的重要环节。近年来，大孔吸附树脂广泛应用于天然植物中活性成分如皂苷、黄酮、生物碱等大分子化合物的提取分离，该方法工艺过程安全、成本低、稳定、效率高[3]。本研究采用大孔吸附树脂法分离纯化穿山龙总皂苷，以洗脱所得总固物的量及总固物中穿山龙总皂苷的含量为考察指标[4]，考察树脂型号、洗脱溶剂用量等工艺条件与药材-树脂比例、色谱柱径高比、洗脱流速、收集洗脱液的量等工艺参数[5]，并与传统的溶剂萃取法相比较，从而确立富集、纯化穿山龙总皂苷可行的方法。

1 仪器、材料和试剂

UV-265FW型分光光度仪(日本岛津公司)。D101型大孔吸附树脂(天津海光化工有限公司)，HPD300、HPD600型大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司)。

高氯酸(分析纯，上海桃浦化工厂)，α-萘酚(上海试剂三厂)。穿山龙药材购于北京同仁堂药店，经北京中医药大学王学勇副教授鉴定为穿龙薯蓣(D.nipponicaMakino)的根茎。薯蓣皂苷对照品为作者从穿山龙中分离纯化得到，采用波谱学等方法(1HNMR、13CNMR，IR)并参考文献[6-7]确证结构，峰面积归一化法计算纯度>98%，符合含量测定要求。

2 穿山龙总皂苷含量测定方法

采用比色法[8]进行测定。

2.1测定波长的选择

高氯酸显色后，以紫外分光光度计在190～700nm扫描，薯蓣皂苷及穿山龙总皂苷的吸收曲线基本一致，且都在406nm处有最大吸收峰，而水洗脱液在该波长下无吸收，故选择406nm为检测波长。

2.2标准曲线的绘制

精密称取薯蓣皂苷对照品5.5mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.550mg·mL-1的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，置具塞试管中，水浴挥干溶剂，精密加入高氯酸10mL，于60℃水浴加热15min，冰水终止反应，随行试剂做空白，于406nm处测定吸光度。以吸光度Y(A)对浓度X(μg·mL-1)绘制标准曲线，计算回归方程为Y=0.0184X-0.0222(r=0.9992)，说明本方法在5.5～55.0μg·mL-1线性关系良好。

2.3供试品溶液的制备与总皂苷含量测定

精密称取穿山龙药材粉末一定量，以20倍体积量的95%乙醇回流提取2次，每次1h。提取液滤过后蒸干，残渣以5倍体积量的10%乙醇溶解，上柱吸附后，洗脱，蒸干洗脱液，甲醇定容，精密吸取一定量，按2.2项下方法自“置具塞试管中”起操作，测定吸光度，代入回归方程，以薯蓣皂苷的量计算穿山龙总皂苷含量。

3 工艺参数考察与优化

3.1树脂保留体积的计算

分别称取等量的不同型号的大孔树脂，以95%乙醇上柱，计算保留体积与树脂干重比例大约为1∶1(V∶M)。树脂经95%乙醇清洗后，以蒸馏水洗至无醇味，待用。

3.2大孔吸附树脂型号的选择

精密称取等量穿山龙药材粉末4份，依2.3项提取、蒸干后，1份直接测定总皂苷含量，以称样量换算成另外3份的“吸附前药液中总皂苷含量”。另外3份以蒸馏水溶解后，分别加于依3.1项处理好的不同型号的树脂柱上，反复吸附12h，取吸附后的药液，测定总皂苷含量作为“吸附后药液中总皂苷含量”。吸附后的树脂用蒸馏水洗至Molish反应呈阴性，以10倍树脂保留体积的95 %乙醇洗脱，取解吸后的药液，测定总皂苷含量作为“洗脱液中总皂苷含量”。不同型号树脂对穿山龙总皂苷的吸附率及洗脱率见表1，结果表明D101型大孔树脂对穿山龙总皂苷的吸附及解吸均优于其他二者，故选择D101型大孔树脂用于总皂苷的制备。

表1 各种型号树脂对穿山龙总皂苷的吸附率及洗脱率

3.3洗脱溶剂的选择

将一定量穿山龙供试液加于已处理好的D101型大孔树脂，蒸馏水洗至Molish反应呈阴性(消耗蒸馏水的量约为20BV)，依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱，每个梯度洗脱5个保留体积，每个保留体积收集1份，每份精密吸取一定量，蒸干溶剂后加高氯酸显色，测定总皂苷含量，以洗脱液序号X(N)为横坐标，每份洗脱液中总皂苷的含量Y(mg)为纵坐标，绘制洗脱曲线，见图1。

1～5号为10 %乙醇洗脱部分 5～10号为30 %乙醇洗脱部分 10～15号为50 %乙醇洗脱部分 15～20号为70 %乙醇洗脱部分 20～25号为95 %乙醇洗脱部分图1 穿山龙总皂苷大孔吸附树脂梯度洗脱曲线图

洗脱曲线显示穿山龙总皂苷主要集中在30%～70%乙醇洗脱液中，占全部乙醇洗脱液中总皂苷的81.10%。为了使上柱药液澄清，避免柱堵塞，采用10%乙醇溶解样品，确定洗脱条件为先用10BV10%乙醇洗去水溶性杂质，再用70%乙醇洗脱穿山龙总皂苷，收集70%乙醇洗脱部分。

3.4树脂分离条件正交试验

以洗脱所得总固物得率及总固物中总皂苷的含量为指标，考察药材-树脂比例、色谱柱径高比和收集洗脱液的量3个因素，每个因素选择3个水平，采用L9(34)正交表(见表2)安排试验进行操作。将收集的洗脱液合并，挥干，40℃烘箱恒重，计算总固物得率；将总固物以甲醇溶解、定容，精密吸取一定量后蒸干溶剂，加高氯酸显色，测定总固物中穿山龙总皂苷的含量，结果见表3。

表2 穿山龙总皂苷提取工艺正交试验因素水平表

3.5结果分析

3.5.1直观分析 表3结果表明各因素对总固物得率的影响为A>C>B，最佳水平组合为A3B1C3。各因素对总皂苷含量的影响为A>B>C，最佳水平组合为A2B3C2。

表3 穿山龙总皂提取工艺正交试验设计及结果

3.5.2 方差分析 表4方差分析结果表明A因素对总固物的得率和总皂苷的含量均有显著影响，B因素只对总皂苷的含量有显著影响，C因素对两指标均无显著性影响。

表4 方差分析表

注：(1)n=2,(2)*P<0.05

3.5.3 综合分析 综合考虑各因素对2个考察指标的影响，考虑在大规模生产中节约树脂及溶剂，缩短生产周期，确定最佳分离条件为A2B3C2，即药材-树脂比例(1∶2)，色谱柱径高比1∶13，收集8 BV洗脱液的量。

3.6重复验证实验

按最佳条件，称取相同重量的穿山龙药材3份，提取后以10%乙醇溶解，加于已处理好的大孔树脂(树脂用量为药材的2倍，色谱柱径高比1∶13)上，先以10BV的10%乙醇洗脱除糖后，用70%乙醇洗脱，收集8BV量的洗脱液，洗脱液蒸干后比色法测定穿山龙总皂苷的含量，结果见表5。

表5 重复验证实验

注：n=3

4 讨论

在考察树脂型号时，选择了D101型、HPD300型、HPD600型3种不同极性的大孔吸附树脂，结果表明非极性的D101型更适合穿山龙总皂苷的富集纯化。原因为皂苷的苷元部分为憎水性，能被非极性树脂所吸附，同时皂苷分子较大，孔径较大的D101型非极性吸附树脂较适合[9]。

由于药液中若有悬浮的微粒存在，有可能堵塞大孔树脂表面的微孔，影响吸附，故上柱前的药液需经过澄清处理。穿山龙总皂苷在水中溶解较差，以水溶解后，离心或过滤后上柱会造成较大损失。采用10%乙醇溶解，溶液较澄清，可直接上柱，且由吸附曲线看出，10%乙醇洗脱液中总皂苷含量很小，故选择10%乙醇溶解后上柱。

总皂苷中各种皂苷化学性质虽属同类成分，分子量差异却较大，如薯蓣皂苷(M=858)，原薯蓣皂苷(M=1078)。采用比色法测定总皂苷时，以分子量低者为参照计算则含量很低，以分子量高者计算含量则很高，甚至可能超过100%，导致计算结果与实际相差悬殊。参考穿山龙指纹图谱研究结果，薯蓣皂苷(螺甾式三糖苷)在RP-HPLC系统中保留较强，推测其为总皂苷中极性较小的皂苷，而其他大部分皂苷极性都大于薯蓣皂苷，可能为分子量也大于薯蓣皂苷的三糖呋甾皂苷或三糖以上皂苷，导致以薯蓣皂苷为参照测定总皂苷含量较低。

实验中还比较了大孔吸附树脂法与传统的正丁醇萃取法富集穿山龙总皂苷，无论总固物的得率，还是总固物中总皂苷的含量，大孔吸附树脂法均优于正丁醇萃取法，且所得总皂苷颜色较浅，收率较高。而且该法克服了传统工艺存在的有机溶剂消耗多、萃取易乳化、糖和色素等杂质除不完全等缺点。操作简单、安全、稳定，适合广泛应用推广。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社,2010：250-251.

[2] 孙麒，巨勇，赵玉芬.具有生物活性的甾体皂苷[J].中草药，2002，33(3)：276.

[3] 刘中秋，蔡雄，赖小平，等.大孔吸附树脂富集纯化三七总皂苷工艺研究[J].中国实验方剂学杂志，2001，7(3)：4.

[4] 石召华，熊富良，李崇明，等.大孔吸附树脂分离纯化三七总皂苷工艺研究[J].中成药，2004，26(1)：10.

[5] 胡军，周跃华.大孔吸附树脂在中药成分精制纯化中的应用[J].中成药，2002，24(2)：127.

[6] 李伯刚，唐易芳，时铱.黄山药中水难溶性甾体皂甙的分离和结构鉴定[J].植物学报，1986，28(4)：409.

[7] 方一苇，赵家俊，贺玉珍，等.穿龙薯蓣中两种水难溶性甾体皂甙的结构研究[J].药学学报，1982，17(5)：388.

[8] 周跃华，吴笑如，徐德生，等.大孔吸附树脂纯化麦冬总皂苷的工艺研究[J].中草药，2003，34(12)：1089.

[9] 徐先祥，夏伦祝，高家荣.大孔吸附树脂在皂苷分离纯化中的应用[J].中国中医药信息杂志，2003，10(1)：79.

OptimizationofthePurificationofTotalSaponinsfromDioscoreanipponicabyMacroporousResin

ZHANG Yuan-yuan1, LIU Rui1, REN Rui2, MO Chou1

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeiingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.GuangdongInstituteforDrugControl,Guangzhou510000,China)

Objective: The optimal technical parameters for total saponins purification with macroporous resin was studied.MethodsOrthogonal test was used to screen the optimal conditions in terms of extraction yield and purity of saponins.ResultsThe optimal condition was as follows: the ratio of total saponins and macroporous resin was1∶2,the resin column diameter-height ratio was1∶13and the amount of desorption solvent was8BV.The extraction yield of total saponins was5.79%～6.27% and the purity reached55.08%～57.79%.ConclusionThe technique was simple,feasible and suitable for industry production.

Dioscorea nipponica; Total saponins; Technique conditions

2011-03-07)