乙酰肝素酶、碱性成纤维细胞因子与非小细胞肺癌血管生成及转移的关系

刘 健，马敏杰，韩 彪，魏 宁

（兰州大学第一医院胸外科，甘肃 兰州 730000）

乙酰肝素酶、碱性成纤维细胞因子与非小细胞肺癌血管生成及转移的关系

刘 健，马敏杰，韩 彪，魏 宁

（兰州大学第一医院胸外科，甘肃 兰州 730000）

乙酰肝素酶；碱性成纤维细胞因子；非小细胞肺癌；肿瘤转移

全世界每年约有131万人死于肺癌，我国是肺癌高发区，因肺癌死亡者仅次于胃癌，居第二位。肿瘤血管新生、浸润和转移是影响非小细胞肺癌预后的重要因素[1]。碱性成纤维细胞因子（BFGF）是目前所知的最重要的促血管生长因子，在肿瘤血管新生中起重要作用。非小细胞肺癌中普遍存在BFGF的高表达，并且和较差的预后[2]、肿瘤进展[3]、血管新生[4]、淋巴浸润和转移[5]相关。在肿瘤血管新生、浸润和转移过程中，不断伴随着新蛋白的合成。这些新蛋白不但为肿瘤细胞增殖、生长所必需，对于血管内皮细胞的增殖也很重要。因此，作为蛋白翻译起始所必需的mRNA帽结合蛋白，乙酰肝素酶（HPs）与肿瘤的血管新生[6]、恶性转化和转移[7]密切相关。HPs表达升高能促进一系列血管新生相关蛋白如BFGF的翻译，因此我们推测：非小细胞肺癌中BFGF和HPs的表达存在着相关性，并且和非小细胞肺癌的分化、分期、血管新生、浸润和转移相关。笔者通过检测131例非小细胞肺癌组织中HPs、BFGF的表达，以探讨其在非小细胞肺癌的发生、发展及转移中的作用，并分析2者的相互关系，以便为非小细胞肺癌的早期诊断、有效治疗及预后提供重要的科学依据。

1 材料及方法

1.1 研究对象

131例组织标本全部取自兰州大学第一医院胸外科2000～2008年资料完整的住院手术患者，患者均经病理证实为非小细胞肺癌，年龄40～73岁，男94例，女37例。所有患者术前均未接受化疗、放疗或针对肿瘤的治疗，均在全麻下行非小细胞肺癌切除术。131例非小细胞肺癌中高分化癌39例，中分化癌75例，低分化癌17例，全部病例按照国际抗癌联盟（UICC）1997年分期标准进行分期，浸润深度：Ti 6例，T110例，T244例，T358例，T413例；淋巴分期：N044例，N187例；远处转移：M0101例，M130例；临床分型：0期1例，Ⅰ期7例，Ⅱa期13例，Ⅱb期51例，Ⅲ期44例，Ⅳ期15例。正常对照组织全部取自手术时切除的、距瘤体约10 cm、均经病理证实为正常的肺组织。

1.2 标本处理

所有标本均经100 mol/L甲醛液固定，常规石蜡包埋，制备成4 μm厚的连续切片5张，1张行苏木精-伊红染色，其余切片贴附于经防脱处理的载玻片上，60℃干燥72 h后，用于不同的免疫组织化学染色。

1.3 实验方法

1.3.1 苏木精-伊红染色 切片进行常规苏木精-伊红染色。

1.3.2 免疫组织化学染色方法 本实验采用S-P染色法检测HPs、BFGF和CD34在各标本上的表达。S-P试剂盒，购自福州迈新生物技术开发公司。将切片进行免疫组织化学标记，3%双氧水室温浸泡5 min，蒸馏水洗，PBS浸泡5 min。5%～10%正常羊血清，室温孵育10 min，倾去血清后加入适当稀释的一抗HPs（鼠单抗，554R16，ABCAM）、BFGF（兔单抗，Santacruz）或 CD34（MAB-0034），37℃孵育 60 min，PBS浸泡 5 min，共 3次。滴加生物素标记的二抗37℃孵育15 min，PBS浸泡5 min，共3次。滴加辣根酶标记的链霉卵白素37℃孵育15 min，PBS浸泡3 min，共3次。DAB显色，水洗后，苏木精复染，分色，返蓝，脱水，透明封固。以PBS代替第一抗体为阴性对照。

1.3.3 观察指标（1）HPs阳性判定标准：HPs、选染色均匀的区域，显微镜下随机选择10个高倍视野计数，阳性细胞数<10%为阴性，≥10%为阳性。切片中癌组织阳性染色弱，阳性范围＜50%癌组织面积者判定为（＋）；染色弱，阳性范围＞50%判定为（＋＋）；染色强，阳性范围＜ 50%判定为（＋＋＋）；染色强，阳性范围＞50%判定为（＋＋＋＋）。并将染色强度（+）～（＋＋）划分为低表达，（＋＋＋）～（＋＋＋＋）划分为高表达[8]。

（2）BFGF阳性判定标准：对BFGF标记切片，采用 Eastham等[9]的方法。即切片中癌组织阳性染色弱，阳性范围＜癌组织面积 50%者判定为（＋）；染色弱，阳性范围＞50%判定为（＋＋）；染色强，阳性范围＜50%判正为（＋＋＋）；染色强，阳性范围＞50%判定为（＋＋＋＋）。并将染色强度（+）～（＋＋）划分为低表达，（＋＋＋）～（＋＋＋＋）划分为高表达[8]。以肿瘤细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。

（3）CD34阳性判定标准：在低倍视野下选取肿瘤微血管数量（CD34阳性）最丰富区域，在200倍视野范围计 5个视野的微血管数目，取平均值作为肿瘤微血管密度（MVD）；以血管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。

1.4 统计学分析

应用统计软件SPSS 13.0分析资料，计数资料采用χ2检验、方差分析，计量资料采用t检验，应用Log-Rank检验比较不同组别患者的生存时间。

2 结果

2.1 非小细胞肺癌及正常肺组织中HPs、BFGF、MVD的表达

131例非小细胞肺癌组织中，HPs阳性105例（80.2%），BFGF阳性99例（75.6%）。20例正常肺组织中未见HPs阳性表达，6例BFGF阳性表达。非小细胞肺癌组织中HPs和BFGF的表达阳性率显著高于正常肺组织（P<0.01）。非小细胞肺癌中MVD计数为（30.59±13.38）个，显著高于正常肺组织的MVD计数（13.82±4.16）个（见表 1）。

表1 HPs、BFGF和MVD在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达

2.2 HPs、BFGF和MVD的表达与非小细胞肺癌分化程度的关系（见表2）

HPs在高、中、低分化非小细胞肺癌中阳性率分别为：66.7%、84.0%、94.1%（P＜0.05）；BFGF 在高、中、低分化非小细胞肺癌中阳性率分别为：74.4%、78.7%、64.7%（P＞0.05）；MVD 在高、中、低分化非小细胞肺癌中分别为：33.13±7.93、31.92±5.29、32.52±6.17（P＞0.05）。本研究提示HPs基因过度表达随恶性度增加而升高，从而证实HPs有使细胞恶性转化的能力。而BFGF、MVD在非小细胞肺癌中的表达与非小细胞肺癌分化程度无关。

2.3 HPs、BFGF和MVD的表达与非小细胞肺癌临床分期的关系（见表2）

HPs在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中阳性率分别为：73.6%、88.1%（P＜0.05）。BFGF在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中阳性率分别为：68.1%、84.7%（P＜0.05）。MVD在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中分别为：35.95±5.19、43.19±7.15（P>0.05）。由此说明，HPs、BFGF 在非小细胞肺癌中的表达与临床分期显著相关（P＜0.05），非小细胞肺癌组织中MVD与临床分期无相关性（P>0.05）。

2.4 HPs、BFGF和MVD的表达与非小细胞肺癌淋巴结转移M分期的关系（见表2）

表2显示，HPs、BFGF在非小细胞肺癌中的表达与非小细胞肺癌淋巴结转移M分期情况呈显著相关性，非小细胞肺癌组织中MVD与非小细胞肺癌淋巴结转移情况无显著相关性。

2.5 HPs 与BFGF在非小细胞肺癌中的关系

HPs在本组非小细胞肺癌中的表达与BFGF的表达有显著性差异（r=0.553，P=0.000），同时，HPs与 BFGF 在本组非小细胞肺癌中的表达与MVD有显著性差异（P=0.000）。

2.6 不同HPs表达水平对非小细胞肺癌患者生存时间的影响（见表 3、图 1）

根据HPs的表达水平将131例患者分成3组，采用Ka－Plan-meier方法描绘3组的生存曲线，用Log-Rank检验比较3组生存时间，3组之间有极显著性差异（P＜0.001）。

表2 HPs、BFGF和MVD在非小细胞肺癌中的表达

表3 Log-Rank检验比较3组生存时间

图1 不同HPs表达水平的非小细胞肺癌患者生存曲线

2.7采用Cox风险比例模型预测影响非小细胞肺癌预后的因素（见表 4）

表4 影响非小细胞肺癌预后的因素分析

采用Cox风险比例模型，拟对131例非小细胞肺癌患者临床病理因素及癌组织中HPs、BFGF、MVD的表达强度进行预后多因素分析。由表4可知HPs的表达程度、远处转移及非小细胞肺癌淋巴结转移是非小细胞肺癌术后影响患者生存时间的危害性因素。

3 讨论

人类乙酰肝素酶基因位于第4条染色体上，有12个外显子，11个内含子，编码区总跨度为39 113个核苷酸，编码区上游2.3 kb区包含一启动子。结构完整的人类乙酰肝素酶CDNA是一个由543个氨基酸残基切除后，形成一个同上C端386个氨基酸残基组成的活性很强的成熟蛋白，分子量约为50 kDa；并且这种前体酶的水解激活是所有参与ECM蛋白降解及细胞浸润酶类的共同特征。同一种族的不同组织细胞间，如人的胎盘、血小板、转移的肿瘤细胞等也表达同一种乙酰肝素酶。癌症的转移是癌细胞从癌组织中突破胞外基质的限制，转移扩散到别的器官并继续增殖所造成的。癌症成为致命的疾病，不仅在于癌细胞的生长失去控制，更在于其转移能力。在转移过程中，细胞粘附、细胞运动、ECM的降解及血管生成是肿瘤转移的决定性因素，在本研究中乙酰肝素酶及碱性成纤维细胞生长因子在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤的浸润及转移密切相关（P<0.001）。同时，与微血管密度在非小细胞肺癌组织中的表达密切相关，本实验结果及相关资料表明乙酰肝素酶及碱性成纤维细胞生长因子的表达与肿瘤细胞转移潜能密切相关。

非小细胞肺癌中普遍存在BFGF的高表达，并且和较差的预后[2]、肿瘤进展[3]、血管新生[4]、淋巴浸润和转移[5]相关。这些高表达的BFGF是否由EIF4e所驱动，对于研究非小细胞肺癌血管新生、浸润和转移的详细机制，进而提供新的治疗靶点具有重要意义。本研究通过在131例不同分化非小细胞肺癌标本中对HPs、BFGF的表达水平检测，发现HPs和BFGF蛋白在非小细胞肺癌中表达阳性率显著高于正常肺组织。高表达的HPs和BFGF与非小细胞肺癌中肿瘤浸润、淋巴转移、远处转移和较高的临床分期呈正相关。我们还检测了HPs与BFGF在非小细胞肺癌中不同区域的表达，分析2者之间的相关性。结果表明，2者之间的相关系数为0.533，提示2者之间密切相关，且成正相关，即HPs的高表达会导致BFGF的表达水平增高。这说明在非小细胞肺癌中，HPs的表达和BFGF具有相似的趋势，2者可能存在某些调节关系。

在许多肿瘤中，HPs和BFGF的表达具有高度相关性。Yang SX等[10]应用组织芯片分析了多种肿瘤来源的组织，发现HPs和BFGF在黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、前列腺癌和卵巢癌等中都具有相关性[10]。BFGF在非小细胞肺癌中是一个重要的预后因子，而HPs的研究相对较少。Salehi等[11]发现HPs在非小细胞肺癌组织中的表达显著高于正常肺组织，并且与进展期非小细胞肺癌密切相关。我们的研究证实了这些发现，同时还首次发现非小细胞肺癌中HPs和BFGF的表达具有高度相关性。

HPs和BFGF高度相关，而BFGF能促进血管新生、导致肿瘤微血管密度增加。我们接着比较了HPs表达和MVD的表达趋势，发现在浸润深度、淋巴转移、远处转移和临床分期方面，2者的表达趋势高度一致。这说明HPs表达能促进血管新生、增加肿瘤微血管密度，这很可能是通过增加BFGF表达介导的。

我们还发现，HPs基因蛋白在高分化、中分化、低分化的表达率是递增的（66.7%、84.0%、94.1%），提示HPs基因过度表达随肿瘤恶性程度增加而升高，从而证实HPs有使细胞恶性转化的能力。而BFGF和MVD在不同分化状态的非小细胞肺癌标本中的表达无显著性差异。这表明HPs在不同分化程度非小细胞肺癌的差异表达和肿瘤细胞增殖、致瘤性等特征相关，这可能与促进生长因子的蛋白翻译有关。我们的研究也证实了其他作者在非小细胞肺癌中的发现：HPs高表达于低分化非小细胞肺癌组织[12]。

我们分析了非小细胞肺癌患者的生存时间，发现HPs表达水平与生存时间显著相关，HPs表达越高，生存时间越短。多因素分析显示：HPs的表达程度、远处转移及非小细胞肺癌淋巴结转移是非小细胞肺癌术后影响生存时间的危害性因素。而BFGF和MVD对生存影响相对较小。

我们的研究不仅揭示非小细胞肺癌高表达BFGF和HPs存在相关，还证实HPs是一个比BFGF更好的、用于预测患者生存的预后因子。这将为研究非小细胞肺癌新的治疗方法提供重要信息，针对HPs的反义核酸在动物体内可以有效抑制肿瘤生长且毒性很小[13]。因而，非小细胞肺癌中，靶向HPs的治疗值得进一步研究。

我们的研究表明：HPs、BFGF协同表达对非小细胞肺癌血管生成、浸润和转移起到关键性的作用。HPs的过度表达与非小细胞肺癌的致瘤性和生存时间密切相关，且能作为非小细胞肺癌恶性程度的一个分子标志和治疗靶标。

[1]Vallb hmer D，Brabender J，Metzger R，et al.Genetics in the Pathogenesis of EsoPhageal Cancer：Possible Predictive and Prognostic Factors[J].J Gastrointest Surg，2009，12：138.

[2]Liu P，Chen W，Zhu H，et al.ExPression of BFGF-C correlates with a Poor Prognosis based on analysis of Prognostic factors in 73 Patients with esoPhageal squamous cell carcinomas[J].JPn J Clin Oncol，2009，39（10）：644～650.

[3]Chen L，Ren GS，Li F，et al.ExPression of livin and vascular endothelial growth factor in different clinical stages of human esoPhageal carcinoma[J].World J Gastroenterol，2008，14（37）：5749～5754.

[4]Ding MX，Lin XQ，Fu XY，et al.ExPression of vascular endothelial growth factor～C and angiogenesis in esoPhageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol，2006，12（28）：4582～4585.

[5]Matsumoto M，Natsugoe S，Okumura H，et al.OverexPression of vascular endothelial growth factor～C correlates with lymPh node micrometastasis in submucosal esoPhageal cancer[J].J Gastrointest Surg，2006，10（7）：1016～1022.

[6]Zhou S，Wang GP，Liu C，et al.HPs and angiogenesis：Prognostic markers for breast cancer[J].BMC Cancer，2006，6：231.

[7]De Benedetti A，Graff JR.eIF～4E exPression and its role in malignancies and metastases[J].Oncogene，2004，23（18）：3189～3199.

[8]Xiangming C，Natsugoe S，Takao S，et al.The cooPerative role of P27 with cyclinE in the Prognosis of advanced gastric carcinoma[J].Cancer，2000，89（6）：1214～1219.

[9]Hughes SE，Hall PA.Overview of the fibroblast growth factor and receP－tor families；comPlexity，functional diversity and imPlication for future cardiovascular reserrch[J].Ardiovascular Res，1993，27（5）：1199～1203.

[10]Yang SX，Hewitt SM，Steinberg SM，et al.ExPression levels of HPs，BFGF and cyclin D1 and correlation of HPs with BFGF and cyclin D1 in multi～tumor tissue microarray[J].Oncol ReP，2007，17（2）：281～287.

[11]Salehi Z，Mashayekhi F.ExPression of the eukaryotic translation initiation factor 4E（HPs）and 4E～BP1 in esoPhageal cancer[J].Clin Biochem，2006，39（4）：404～409.

[12]Wang R，Geng J，Wang JH，et al.OverexPression of（HPs）and its clinical significance in lung adenocarcinoma[J].Lung Cancer，2009，66（2）：237～244.

[13]Graff JR，Konicek BW，Vincent TM，et al.TheraPeutic suPPression of translation initiation factor HPs exPression reduces tumor growth without toxicity[J].J Clin Invest，2007，117（9）：2638～2648.

G424.31

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1671-1246（2011）08-0091-04

本文系甘肃省科学事业项目“乙酰肝素酶、碱性成纤维细胞因子在肺癌中的表达及临床意义”（QS061-C33-13）的研究成果