高效液相色谱-串联质谱测定猪肝中阿维菌素、伊维菌素残留

郑卫东，胡江涛，阴文娅*，盛 毅，武志雄

(1.四川省产品质量监督检验检测院，四川 成都 610031；2.四川出入境检验检疫局，四川 成都 610041；3.四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，四川 成都 610041)

高效液相色谱-串联质谱测定猪肝中阿维菌素、伊维菌素残留

郑卫东1，胡江涛2，阴文娅3,*，盛 毅2，武志雄3

(1.四川省产品质量监督检验检测院，四川 成都 610031；2.四川出入境检验检疫局，四川 成都 610041；3.四川大学华西公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，四川 成都 610041)

目的：建立高效液相色谱-四极杆串联质谱仪(LC-MS/MS)同时测定猪肝脏中阿维菌素(AVM)和伊维菌素(IVM)的残留量。方法：猪肝样品均质后用乙腈提取，碱性氧化铝固相萃取柱(SPE)净化，采用串联质谱电喷雾电离ESI(+)，多反应监测模式(MRM)检测，以保留时间和子离子比定性，外标法定量。结果：方法检出限(LOD)均为2.0μg/kg，定量限(LOQ)为5.0μg/L，两种药物的线性范围均为5～100μg/L，相关系数均为0.9999。添加水平在2～20μg/kg范围内，阿维菌素和伊维菌素的平均回收率分别为77.0%～83.3%和76.9%～79.8%之间，相对标准偏差(RSD)分别小于12.1%和13.0%。结论：方法操作简单，灵敏准确，可满足当前国内外该产品中此类药物的检测要求。

猪肝；阿维菌素；伊维菌素；高效液相色谱-串联质谱

阿维菌素(a v e r m e c t i n，A V M)和伊维菌素(ivermectin，IVM)[1-2]是由阿维链霉菌产生的一组广谱、高效、安全的大环内酯类抗寄生虫药，对体内外寄生虫特别是线虫和节肢动物均有良好的驱杀作用，国内外在猪、牛、羊等家畜中使用广泛。AVMs主要分布于动物肝脏和脂肪组织中，且在动物体内残留时间长，动物实验也证实阿维菌素具有生殖毒性，长期暴露可能对人体具有严重健康损害危险，且对水生环境有剧毒性。各国都制定了阿维菌素最高残留限量(MRLs)[3-5]。

据文献报道，目前阿维菌素的检测方法[6-13]主要有高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、液质联用法(LC-MS)等。已有方法主要是对药物制剂含量、植物、牛肉及尿液中阿维菌素残留量的测定。最新颁布的行业标准阿维菌素类药物残留的液相色谱-串联质谱分析方法也仅适用牛肉及牛肝[14]，还没有针对猪肝的液相色谱-串联质谱检测方法。猪肝基质复杂，常规的检测方法易出现假阳性、色谱峰易受杂质干扰，因此对前处理要求也较高。本实验采用超高效液相色谱-电喷雾四极杆串联质谱同时测定猪肝中的阿维菌素和伊维菌素，并对提取溶剂、净化方法以及测定技术进行研究，方法操作简便，定性定量准确，灵敏度等各项技术指标满足残留检测的要求，以期为阿维菌素和伊维菌素的检测研究提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪肝组织，搅碎混匀。

标准品阿维菌素(纯度≥96%)、伊维菌素(纯度≥98%) 德国Augsburg公司；乙腈、正己烷、乙酸、乙酸铵(均为色谱纯) 美国Tedia公司；无水硫酸钠(分析纯，650℃灼烧4h，贮藏于干燥器中备用)；氯化钠(分析纯，400℃灼烧2h，贮藏于干燥器中备用)。

1.2 仪器与设备

ABI4000高效液相色谱-三重四极质谱联用仪(配有电喷雾离子源) 美国ABI公司；IKA-WERKE型高速组织匀浆机 德国IKA公司；B8500S-DTH超声波清洗器上海必能信超声有限公司；LG10-2.4A离心机 北京医用离心机厂；Anpelclea碱性氧化铝SPE柱(6mL，1000mg，使用前用10mL乙腈活化) 上海安谱科学仪器有限公司；水浴氮吹仪。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

乙腈饱和的正已烷：取50mL乙腈加入到1000mL正已烷中，充分混匀，分层后取正已烷层备用。

阿维菌素和伊维菌素标准储备溶液：准确称取适量标准品(精确至0.1mg)，用乙腈配制成质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，置－18℃冰箱中避光保存。

空白样品提取液：准确称取20g空白猪肝脏组织，加入100mL乙腈，样品的前处理提取后合并提取液用足量无水硫酸钠脱水，再用20mL乙腈饱和正已烷除脂，备用。

1.3.2 色谱与质谱条件

Pickering laboratories C8柱(150mm×4.6mm，5μ m)；柱温：25℃；流动相：乙腈:(0.1%乙酸-5mmol/L乙酸铵)=90:10(V/V)；等度洗脱；流速：0.6mL/min；进样量：2 0μL。

电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描，多反应监测(MRM)。高纯氮气为载气、碰撞气和气帘气，电喷雾电压(IS)＋5500V，去簇电压(DP)12V，雾化气压力(GAS1)30psi，气帘气压力(CUR)20psi，辅助气压力(GAS2)40psi，离子源温度(TEM)400℃，驻留时间300ms。

1.3.3 样品的前处理

提取：称取5.0g匀浆后的新鲜猪肝脏组织至50mL离心管中，加5g无水硫酸钠、1g氯化钠和20mL乙腈，高速匀浆2min，超声30min，4000r/min离心10min。取上清液至容量瓶，残渣分别用15、10mL乙腈重复提取离心两次，合并上清液，用乙腈定容至50mL，待净化。

净化：取提取液25mL过碱性氧化铝小柱(已活化)，之后用4mL乙腈淋洗，收集全部流出液，控制流出液的速度低于1.0mL/min。再经无水硫酸钠脱水后，在50℃水浴下用氮气吹至近干，用1.0 mL流动相溶解残渣，过有机微孔滤膜(0.22μm)后，供LC-MS/MS测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

本实验选用广泛使用的ESI作为离子源，[M+NH4]+离子为两待测物的母离子，在流动相中加乙酸和乙酸铵以增强待测物的离子化。对AVM和IVM混合标准溶液(1mg/L)在正离子模式下对母离子进行全扫描，找出AVM和IVM的[M+NH4]+峰，以该分子离子峰对离子源参数(IS、GAS1、GAS2、CUR、TEM等)进行优化，使仪器灵敏度达到最高。再对子离子进行二级质谱全扫描，选取二级质谱中没有干扰、信号相对较强的2个特征碎片离子，与其母离子组成两对离子对，对该药物进行定性和定量分析。AVM和IVM的母离子/子离子及碰撞能量见表1，提取离子色谱图见图1。

表1 AVM和IVM的母离子、子离子及碰撞能量Table 1 Parent and daughter ions and collision energy of avermectin and ivermectin

图1 AVM和IVM的提取离子色谱图(添加水平10μg/L)Fig.1 Ion chromatograms of avermectin and ivermectin standards

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

阿维菌素类药物是一类相对分子质量较高的弱极性化合物，选用反相高效液相色谱进行分离较合适。本实验对C8和C18两种色谱柱进行比较，结果发现：阿维菌素和伊维菌素在C18柱上出峰太快，不能完全和杂质分开，且响应强度较低；而其在C8柱上则能完全与杂质分离，且峰型更尖锐，响应强度也较C18上的大得多。进一步比较3个品牌的C8色谱柱，发现不同厂家的C8柱间存在着差别，最终选定产生峰形和响应强度最好的Carbamate Analysis C8(150mm×4.6mm，5μm)为实验所用色谱柱。

2.2.2 流速和柱温的选择

本实验比较0.2、0.4、0.5、0.6、0.7mL/min流速时，待测物的峰型和响应强度等指标，结果显示流速加大，待测物的响应有一定增加，增大质谱雾化气流速后，质谱的响应强度趋于稳定，最终确定0.6mL/min为理想流速。实验表明柱温对两种化合物的分离基本没有显影响，考虑室温，选定柱温为2 5℃。

2.2.3 流动相的选择

图2 空白猪肝脏组织的色谱图Fig.2 Chromatogram of blank pork liver tissue

本实验选用ESI正离子模式，[M+NH4]+离子为母离子，在流动相中加入5mmol/L乙酸铵可促进母离子的形成，同时加入0.1%乙酸来增强待测物的离子化。比较甲醇和乙腈，结果显示甲醇作流动相时，两待测物的峰形延展较宽，响应强度较低，有时会出现同物质的双峰现象；乙腈作流动相时，两物质出峰的峰型和响应强度均比甲醇好，特别是伊维菌素的响应有成倍的增强，最终选择乙腈:缓冲液(0.1%乙酸-5mmol/L乙酸铵)=90:10(V/V)为流动相。在所选的最佳仪器条件下，空白猪肝脏组织及其加混标10μg/kg阿维菌素和伊维菌素的色谱图分别见图2、3。

图3 空白猪肝脏组织添加10μg/kg标准品的色谱图Fig. 3 Chromatogram of blank swine liver tissue spiked at 10μg/kg

2.3 样品处理条件的选择及优化

2.3.1 提取条件的选择

参考国内外文献资料，大多选用乙腈作为样品提取溶剂。乙腈与水任一比混溶，很容易渗透到组织内部，提取效率高，且乙腈本身对样品中的糖、脂肪和蛋白质的溶解性较小，对蛋白又有沉淀作用，所以实验选用乙腈作为提取溶剂。

2.3.2 净化方法的选择

常用的净化方法有乙腈饱和的正己烷液-液萃取法和C18柱、中性氧化铝柱、碱性氧化铝柱固相萃取法。本实验比较几种净化方法的去脂效果，结果发现：乙腈饱和的正己烷、C18及中性氧化铝小柱的去脂效果均不甚理想，且回收率在60%以下，而碱性氧化铝小柱不仅去脂效果好，而且回收率也高，可达80%，完全能满足方法要求，所以本实验确定用碱性氧化铝柱净化。

同时进行碱性氧化铝柱洗脱效率的实验，以验证小柱对阿维菌素和伊维菌素的吸留作用。实验表明：样品提取液过柱后，固相萃取柱再用2mL乙腈即可将残留的阿维菌素和伊维菌素完全洗脱，过量的洗脱液可能将小柱吸附的杂质洗脱，综合考虑采用4mL乙腈来洗脱柱内吸留待测物。

2.4 方法线性方程和检出限

实验比较乙腈和空白样品提取液作为标准的稀释液配制标准系列，发现猪肝脏样中存在着基质减弱效应，使得阿维菌素和伊维菌素的仪器响应不理想，回收率偏低；本实验用空白猪肝样品提取液配制标准，以补偿基质效应[15]吸取标准贮备液，用阴性猪肝脏组织的空白提取液稀释成0.005、0.010、0.020、0.050、0.100mg/L标准溶液，按1.3.2节的仪器条件进行测定。用选定的定量离子峰面积(Y)对质量浓度(X)绘制标准曲线，得线性方程及相关系数见表2。

表2 阿维菌素和伊维菌素的线性方程、相关系数Table 2 Linear equations and correlation coefficients for the determination of avermectin and ivermectin

以10倍信噪比所对应的待测物质量浓度为最低定量质量浓度，根据样品的浓缩倍数，确定本方法定量限为5.0μg/L，样品定量限为2.0μg/kg，线性范围是5～100μg/L，在线性范围以外时，可适当增大样品最终定容体积或减小样品净化体积。

2.5 方法回收率和精密度

2.5.1 方法回收率

选取不含阿维菌素和伊维菌素本底的猪肝脏组织样品，进行不同添加水平的阿维菌素和伊维菌素加标回收实验，添加水平为2、10、20μg/kg三个添加水平，每个质量浓度做10个平行样，阿维菌素样品添加平均回收率在77.0%～83.3%之间，相对标准偏差在8.6%～12.1%之间；伊维菌素样品添加平均回收率在76.9%～79.8%之间，相对标准偏差在9.9%～13.0%之间。回收率满足要求。回收率结果见表3。

表3 阿维菌素和伊维菌素加标回收率实验(n=10)Table 3 Spike recovery rates for avermectin and ivermectin

2.5.2 方法精密度

表4 阿维菌素精密度实验结果 (n=10)Table 4 Precision of this method in avermectin determinationμg/kg

表5 伊维菌素精密度实验结果(n=10)Table 5 Precision of this method in ivermectin determinationμg/kg

3 结 论

本实验建立猪肝脏组织中阿维菌素类药物残留的液相色谱-串联质谱法，其前处理过程简单，灵敏度高，准确度、精密度和各项技术指标均满足国内外残留检测的相关要求，可用于猪肝脏组织中阿维菌素类药物残留的检测。

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Determination of Avermectin and Ivermectin Residues in Pork Liver by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

ZHENG Wei-dong1，HU Jiang-tao2，YIN Wen-ya3,*，SHENG Yi2，WU Zhi-xiong3
(1. Sichuan Institute of Product Quality Supervision and Inspection, Chengdu 610031, China；
2. Sichuan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Chengdu 610041, China；
3. Department of Nutrition and Food Hygiene, West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Objective: To establish a method for the simultaneous determination of avermectin and ivermectin residues in pork liver using high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS).Methods: Avermectin and ivermectin residues were extracted with acetonitrile, cleaned up on a solid phase extraction (SPE)column containing alkaline aluminum oxide, separated on a C8 column, detected by tandem mass spectrometry with electrospray ionization and multiple reaction monitoring interface and quantitatively determined by high performance liquid chromatography in an external standard manner. Results: The limits of detection (LOD) for avermectin and ivermectin were 2μg/kg and limits of quantitation were 5μg/L. Both the linear ranges of avermectin and ivermectin were 5－100μg/L with correlation coefficients of both 0.9999. The recovery rate range of this method was 77.0%－83.3% for avermectin and 76.9%－79.8% for ivermectin with relative standard deviations (RSD) of 8.6%－12.1% and 9.9%－13.0% at spike levels of 2, 10μg/kg and 20μg/kg,respectively. Conclusion: This method is simple, sensitive and accurate, which can meet the domestic and international requirements for the detection of both veterinary drugs.

pork liver；avermectin；ivermectin；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

R155.5

A

1002-6630(2011)04-0185-04

2010-03-11

四川省科技厅应用基础研究项目(04JY029-033)

郑卫东(1964—)，男，教授级高级工程师，硕士，研究方向为食品分析。E-mail：axlzwd2004@126.com

*通信作者：阴文娅(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为营养与食品卫生学。E-mail：yinwenya@126.com