基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157:H7检测

蒲小平，杨海麟，周楠迪*

(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

基于生物条形码探针和金纳米颗粒的大肠杆菌O157:H7检测

蒲小平，杨海麟，周楠迪*

(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

建立一种基于生物条形码探针和金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)对致病性大肠杆菌O157:H7检测的新方法。用生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles，MNPs)和AuNPs与目标物大肠杆菌O157:H7进行免疫反应，形成MNPs/目标物/AuNPs“三明治”式复合体。利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来，通过DNA探针杂交条形码DNA引起AuNPs颜色变化来确定大肠杆菌O157:H7的存在，这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析，该方法在纯样品和牛奶中最低检测限为102CFU/mL，检测范围为102～106CFU/mL。应用基于生物条形码探针和AuNPs对大肠杆菌O157:H7检测具有准确、快速、操作简单的优点，为食品安全监测提供了新的方法。

磁性纳米颗粒；金纳米颗粒；生物条形码；紫外-可见分光光度法；大肠杆菌O157:H7

大肠杆菌O157:H7(E. coli O157:H7)是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型，自1982年在美国首次被分离并确认为食物中毒新型致病菌以来[1]，此菌在世界范围内发生过多次暴发，并造成严重危害。食用被该菌污染的食物可导致人类腹泻、出血性肠炎，并可继发溶血性尿毒综合征(haemolytic uraemic syndrome，HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)等严重的并发症[2]。因此，该菌引起了各国食品安全管理机构的高度关注。目前，食品中大肠杆菌O157:H7的检测主要依靠常规的细菌学培养方法、PCR、ELISA，但这些方法存在操作繁琐，检测周期长，并且受样品复杂成分的影响等弊端，极大地限制了在食品行业中对该菌污染的有效监控[3-5]。因此，建立一种简单、快速、准确、灵敏的检测方法十分必要。

生物功能化的磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles，MNPs)能够利用MNPs表面抗体特异性吸附需检测的致病菌，并利用磁场对致病菌进行富集，从而可以实现对致病菌的快速分离[6-8]。另外，生物条形码检测(bio-bar codes assay，BCA)可实现对检测物的间接放大，被广泛应用于对DNA[9]和蛋白质[10-12]的高灵敏检测。然而，目前的生物条形码检测需要对条形码DNA进行PCR扩增，对扩增后的条形码进行电泳或者芯片检测，因此检测依赖昂贵的设备，限制了该方法在实际中的应用。金纳米颗粒(gold nanoparticles，AuNPs)由于易于制备和修饰，具有独特的理化性质和优良的生物相容性而成为生物诊断中最热门的材料，因此被广泛使用[13-14]。Mirkin等[15]报道了巯基修饰的单链DNA标记的AuNPs在DNA的交联作用下发生聚集现象，AuNPs的聚集很容易直接观察到并且可以用紫外-可见吸收光谱、透射式电镜等进行表征，这一原理报道以来已被应用于对生物分子的检测[16-17]。

本研究以大肠杆菌O157:H7为检测对象，通过制备生物功能化的MNPs和AuNPs，利用条形码DNA识别互补序列和AuNPs的凝聚变色效应，设计一种新型的对大肠杆菌O157:H7检测方法。如图1所示，当大肠杆菌O157:H7存在时，形成MNPs/目标物/AuNPs“三明治”式复合体，利用磁场将其从溶液中分离出来，利用去杂交将AuNPs上标记的条形码DNA释放出来，条形码DNA作为AuNPs之间的桥梁，会引起AuNPs聚集，聚集引起的颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱定量分析，从而建立一种简单、快速、准确、灵敏的基于生物条形码探针和AuNPs的检测方法。

图1 基于生物条形码探针和AuNPs的大肠杆菌O157:H7检测方法Fig.1 Detection of E. coli O157:H7 based on bio-bar codes probes and AuNPs.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛奶 伊利集团。

氯金酸(HAuCl4) 上海久岳化工有限责任公司；大肠杆菌O157:H7单克隆抗体和多克隆抗体 宁波良瑞生物技术公司；牛血清蛋白(BSA) 上海丽珠东风生物技术有限公司；DNA由上海赛百盛基因技术有限公司人工合成，烷基硫醇修饰的条形码D N A捕捉链：5'-CATCTACACTCTTCACATCGAGAGTTGCAACTGTCTGAGTA10-(CH2)3-SH-3'，条形码DNA链：5'-ACTCAGACAGTT GCAACTCTCGATGTGAAGAGTGTAGATG-3'， A探针链：5'-AGAGTTGCAACTGTCTGAGT-A10-SH-3'，B探针链：5'-SH-A10-CATCTACACTCTTCACATCG-3'。其他化学试剂均为分析纯；实验用水为灭菌超纯水。

1.2 菌株

大肠杆菌O157:H7、O111、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌由本实验室保存，并通过生化试验和血清学方法鉴定；大肠杆菌O86(CVCC 3368) 国家兽医微生物保藏中心。

1.3 仪器与设备

UV-3000紫外分光光度计、透射电子显微镜 日本Hitachi有限公司。

1.4 方法

1.4.1 生物功能化的金纳米颗粒制备

通过氯金酸还原柠檬酸三钠制备AuNPs[18-19]，并通过紫外-可见吸收光谱以及TEM表征。取1mL 10nmol/L AuNPs溶液，用K2CO3调pH值至9，加入10μg大肠杆菌 O157:H7多克隆抗体。20min后，将多克隆抗体修饰的纳米颗粒与烷基硫醇修饰的条形码DNA捕捉链(终浓度为2μmol/L)反应12h，然后在0.1mol/L NaCl溶液、0.01mol/L PBS(pH7.0)中盐稳定。接着，该溶液用1mL 10g/100mL BSA溶液处理20 min以钝化和稳定AuNPs。最终溶液在4℃条件14000r/min离心25min，去掉上清液，重复操作2次。然后将大肠杆菌O157: H7特异性的条形码DNA链(终浓度为3μmol/L)与连接到纳米颗粒上的条形码DNA捕捉链杂交并使用相同的离心方法纯化。

1.4.2 生物功能化的磁性Fe3O4纳米颗粒的制备

1.4.2.1 磁性Fe3O4纳米颗粒的合成和表面修饰

按照Chang等[20]方法制备MNPs，并用TEM鉴定粒径。MNPs表面的修饰是采用3-氨丙基三乙氧基硅烷(A P T E S)，通过硅烷化反应以化学键的方式结合MNPs，获得表面氨基化的MNPs，具体步骤是取3g制得的MN Ps溶于90 mL蒸馏水中，为了更好的分散MNPs，需将该溶液进一步超声30min，然后转入到三颈烧瓶中氩气保护，大约滴加10mL APTES到以上混合溶液中，继而在120℃搅拌反应3h，反应结束后，产物通过磁分离，用去离子水洗涤3次，70℃真空干燥过夜得到氨基化修饰的磁性MNPs。

1.4.2.2 磁性Fe3O4纳米颗粒表面氨基的活化和抗体偶联

称取经氨基修饰过的MNPs 10mg重悬于0.5mL浓度为0.1mol/L PBS(pH7.4)中并超声5min，然后加入1.5mL的体积分数8%的戊二醛溶液(该溶液由25%戊二醛与PBS配制而成)，室温振荡反应7h(反应避光，以避免戊二醛自身发生聚合)。磁性分离，用PBS清洗纳米颗粒3～5遍，重新悬于5mL PBS溶液中，即生成活化的MNPs。取1mL活化的MNPs，加入大肠杆菌O157:H7单克隆抗体0.5mg，室温搅拌反应4h，磁性分离，吸取上清至另一试管中；用PBS洗涤3～5遍，以去除未结合的游离抗体，回收洗涤液，并把它与上述反应后的上清液进行汇合，备测蛋白浓度。向偶联后的MNPs加过量1g/100mL BSA溶液，室温反应2h，以封闭未结合抗体的游离醛基，即制备出生物功能化的MNPs，以紫外-可见吸收光谱比较抗体与MNPs偶联前后在280nm波长处的吸光度测定偶联效率。

1.4.3 探针修饰的金纳米颗粒的制备

按照Mirkin等[21]所述方法稍加改进。82.5μg巯基修饰的A和B探针链分别溶解于100μL去离子水，然后加入到900μL 17nmol/L AuNPs溶液中，使A、B探针的终浓度达到3.70μmol/L，室温放置16h，加入含0.1mol/L NaCl的0.01mol/L PBS(pH7.0)，在13000r/min转速下离心20min，弃上清液，向油状沉淀中加入0.1mol/L NaCl溶液、0.01mol/L PBS重悬红色油状沉淀，在13000r/min转速下离心20min，移去上层清液，加1mL 0.3mol/L NaCl、0.01mol/L PBS(pH7.0)重悬沉淀，置4℃储存备用。

1.4.4 大肠杆菌O157:H7样品的制备

将大肠杆菌O157:H7接种到LB液体培养基中，37℃过夜培养进行增菌。接着将增菌液分装于两个离心管，在25℃条件5800r/min离心分离10min。用PBS清新3次，加PBS(pH7.4)重新悬浮沉淀。然后测定在600nm波长处的吸光度，估计其菌数，然后按10倍梯度稀释，并在山梨醇-麦康凯琼脂培养基上进行平板菌落计数确认，重复3次，取平均值确定其菌液菌落数。

1.4.5 基于生物条形码探针和金纳米颗粒检测方法的建立

将50μL功能化的MNPs(5mg/mL)加入到200μL不同浓度的大肠杆菌O157:H7溶液中，于37℃振荡25min；加入磁场固定MNPs，用PB S溶液反复冲洗；加入10nmol/L功能化的AuNPs 50μL，于37℃剧烈振荡30min，形成MNPs/目标物/AuNPs“三明治”式复合体；加上磁场分离“三明治”式复合体；用1 0 0μL PBS溶液反复冲洗4次，除去未连接的AuNPs；加入5 0μL超纯水到”三明治“结构中，6 0℃剧烈振荡30min，使条形码DNA去杂交。”三明治“复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA，用探针修饰的AuNPs进行检测。

取上述条形码DNA溶液50μL，向其中加入探针(A和B)修饰的AuNPs各100μL，混匀后95℃变性5min，55℃杂交2h后观察颜色变化和紫外-可见吸收光谱定量分析。

2 结果与分析

2.1 生物功能化的金纳米颗粒表征

按照实验方法制备的AuNPs的紫外-可见吸收光谱，其最大吸收波长为520nm(图2a)，TEM观察AuNPs平均粒径为13nm，大小均匀，分散性良好。抗体修饰到AuNPs表面后，相比未修饰的AuNPs的紫外-可见吸收峰有4nm的红移(图2b)。而抗体和条形码DNA共同修饰的AuNPs的紫外-可见吸收峰在527nm，红移3nm (图2c)，按照荧光测定方法[22]测定AuNPs表面连接DNA的数量大约为100。

图2 未修饰AuNPs (a)、抗体修饰AuNPs (b)、抗体和DNA双修饰AuNPs (c)的紫外可见吸收光谱图Fig.2 UV-visible spectra of un-modified AuNPs (curve a), antibodymodified AuNPs (curve b), and antibody and DNA modified AuNPs (curve c)

2.2 生物功能化磁性Fe3O4纳米颗粒表面抗体偶联效率测定

按照实验方法制备的MNPs平均粒径为(27±4)nm，通过紫外-可见吸收光谱比较抗体与MNPs偶联前后在280nm波长处的吸光度测定抗体偶联效率为83.85%。

2.3 大肠杆菌O157:H7标准样品检测结果

利用基于生物条形码探针和AuNPs的方法检测大肠杆菌O157:H7，当目标微生物大肠杆菌O157:H7存在时(105CFU/mL)，AuNPs标记的条形码DNA释放出来，识别带有互补序列的探针修饰的AuNPs，并使AuNPs相互交联，形成网状结构的超分子聚集体，体系颜色由红色变为紫色或者蓝色，在525nm波长处吸收显著降低；相反，当目标微生物不存在时，无条形码DNA释放出来，AuNPs不会发生聚集，体系颜色保持红色不变，在525nm波长处最大吸收峰无变化(图3)，所以根据探针修饰AuNPs聚集颜色的变化可以检测大肠杆菌O157:H7。

图3 大肠杆菌O157:H7的检测结果Fig.3 Detection of E. coli O157:H7

利用基于生物条形码探针和AuNPs的方法对不同浓度的大肠杆菌O157:H7进行检测，不含菌的试样液为空白对照，观察体系颜色变化和测定在520nm波长处的吸光度。结果显示当菌落数低于102CFU/mL时，体系的颜色无明显变化，随着大肠杆菌O157:H7菌落数的递增，体系的聚集现象就越明显(图4A)；而吸光度的检测同样表明菌落数低于102CFU/mL时，吸光度基本没有明显差异(图4B)，此后随着菌落数的增大，AuNPs的吸光度出现明显的下降，当菌落数增加到107CFU/mL时，吸光度已无明显变化(图4B)。因此利用光谱法检测大肠杆菌O157:H7，最低检测限为102CFU/mL，检测范围为102～106CFU/mL。

图4 不同菌落数的大肠杆菌O157:H7检测结果Fig.4 Detection of E. coli O157:H7 samples with different Log numbers

用大肠杆菌O86、O111、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌进行特异性实验，方法同检测大肠杆菌O157:H7，只是培养基改为适合被检测菌生长的培养基，菌落数为105CFU/mL。AuNPs聚集和吸光度测定结果(图5)表明除大肠杆菌O157:H7出现很好的阳性结果外，其他细菌检测均呈阴性。因此，基于生物条形码探针和AuNPs的方法对大肠杆菌O157:H7检测具有很好的特异性。

图5 大肠杆菌O157:H7特异性检测结果Fig.5 Specificity of detection for E. coli O157:H7

2.4 对人工污染牛奶检测结果

为了考察本方法检测效果，制备了大肠杆菌O157: H7污染牛奶样本，将不同菌落数的大肠杆菌O157:H7菌液人工污染到牛奶中，污染菌落数分别为10、102、103、104、105、106、107CFU/mL。检测结果如图6所示，表明在人工污染牛奶中能检测到102CFU/mL的细菌，检测范围为102～106CFU/mL。

3 结 论

本研究制备的生物功能化的MNPs具有比表面积大的特点，当颗粒表面被微生物特异性抗体连接后，能够快速、高效、特异性分离大肠杆菌O157:H7，而生物功能化的AuNPs携带有大量的生物条形码，可对标检目标物间接放大，利用生物条形码与互补DNA探针液相杂交，使AuNPs聚集形成网状结构的超分子聚集体，体系颜色由红色变为紫色或者蓝色，这种颜色变化很容易用裸眼观察到并且可以通过紫外-可见吸收光谱进行定量分析，对纯样品和人工污染的牛奶检测最低限为102CFU/mL，检测范围为102～106CFU/mL，该方法不受样品复杂成分的影响，因此，本实验建立的基于生物条形码探针和AuNPs的检测方法具有简便、快速、准确、可靠等优点，为食源性病原微生物的鉴定和诊断提供了一种新方法。与其他病原微生物检测技术相比，该技术具有非常显著的特点，首先可以针对不同的病原微生物设计不同长度和序列的条形码DNA，可同时对食品中的多种病原微生物进行分析；其次检测范围广，只要能够获得被检物的单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得该技术在检测一些不适宜用PCR技术检测的病原微生物时具有很大的优势；再次是结果准确、易于判读，根据AuNPs的颜色变化，利用裸眼和紫外-可见吸收光谱就可以进行定性定量分析。该技术也存在一定的缺点，如其特异性取决于检测系统使用的单克隆抗体的特异性，而目前商品化的单克隆抗体费用相对较高，会影响该技术在实际检测中的应用。总体而言，利用该方法有望制备出检测试剂盒产品，在食源性病原微生物检测中推广使用，但为了实现这个目标还有很多工作要做。

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Detection of Escherichia coli O157:H7 Based on Bio-Bar Codes Probes and Gold Nanoparticles

PU Xiao-ping，YANG Hai-lin，ZHOU Nan-di*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A novel assay was developed for the detection of Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) based on bio-bar DNA and gold nanoparticles (AuNPs). The immune reaction between the target and antibodies modified on biofunctionalized magnetic nanoparticles (MNPs) or AuNPs leads to the formation of a sandwich structure of MNPs/target/AuNPs, followed by dehybridization and release of bio-bar DNA. Due to its ability to hybridize with probe ssDNAs modified on AuNPs, bio-bar DNA could lead to aggregation and color change of AuNPs, which is readily visible with naked eyes, and can be quantified by UV-visible spectroscopy as well. The proposed method had a detection limit of about 102CFU/mL in both pure broth culture and milk with a detection range of 102－106CFU/mL. With the aid of bio-bar DNA and AuNPs, detection of E. coli O157: H7 in food is accurate, fast, and easy-operated, which may provide a new tool for food safety monitoring.

magnetic nanoparticles；gold nanoparticles；bio-bar codes；UV-visible spectroscopy；E. coli O157:H7

R446.5

A

1002-6630(2011)08-0177-05

2010-06-29

国家自然科学基金青年项目(20805020)；教育部科学技术研究重点项目(109079)；食品科学与技术国家重点实验室开放课题(SKLF-KF-200809)

蒲小平(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为食品安全及检测。E-mail：puxiaoping2008@qq.com

*通信作者：周楠迪(1974—)，男，副教授，博士，研究方向为生物分析与检测。E-mail：zhounandi@jiangnan.edu.cn