超临界体系酶法催化甘油解制备甘油二酯的研究

任运宏，孙 博，刘 晶，江连洲，于殿宇

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

超临界体系酶法催化甘油解制备甘油二酯的研究

任运宏，孙 博，刘 晶，江连洲，于殿宇*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

对在CO2超临界体系酶法催化甘油解反应制备甘油二酯进行研究，考察了底物大豆一级油/甘油的摩尔比、反应温度、加酶量、加水量、时间和搅拌速度等因素对甘油二酯含量的影响。通过单因素与正交实验，确定了最优工艺条件为：大豆一级油与甘油摩尔比2∶1，反应温度65℃，加酶量2.5%，甘油含水量1%，反应时间7h，搅拌速度120r/min，得到反应产物中甘油二酯含量为70.2%，其中1，3-甘油二酯含量达56.2%。与常规甘油解相比，甘油二酯含量要高出7%左右，其中1,3-甘油二酯含量要高出5%左右，并且，时间减少2h左右。

大豆油，甘油解，脂肪酶Lipozyme RMIM，CO2超临界，甘油二酯

随着人们生活水平的提高、不良生活习惯的形成，肥胖症、心血管疾病、脂肪肝等富贵病越来越普遍，目前已严重威胁人类的健康。甘油二酯不仅能改善食品风味，延长储存期，而且是功能食品的主要添加剂，能减少体内的脂肪堆积，预防和治疗高血脂及相关疾病[1-3]。甘油二酯（diglyceride，DAG，也称甘二酯）是油脂的天然成分，是油脂代谢的中间产物[4]。甘油二酯安全性高，已经通过了美国FDA认证，是“世界公认安全（GRAS）”的食品成分[5]。根据酰基与甘油羟基结合的位置不同，可将其分为1，2-DAG和1，3-DAG两类[6]。从现有信息来看，甘油解法似乎是生产甘油二酯最经济的方法，也是目前工业上主要采用的方法[7]。当一种流体处在高于其临界点的温度和压力下，被称之为超临界流体（SCFs），它既具有与气体相似的密度、粘度、扩散系数等物性，又兼有与液体相近的特性，是处于气态和液态之间的中间状态的物质[8]。纯CO2的临界压力为7.39MPa，临界温度为31.06℃，当反应压力、温度高于临界点，被称为超临界CO2。这是一种可压缩的高密度流体，是通常所说的气、液、固三态以外的第四态，超临界CO2的分子间力很小，类似于气体；而密度却很大，接近于液体，是一种气液不分的状态，没有相界面，也就没有相际效应，有助于提高反应效率，并可大幅度节能[9]。超临界状态下流体CO2同时起到溶剂和催化剂的作用，由于CO2是非极性分子，可避免其它方法出现中毒和催化剂失活的现象。另外，该反应环境下可阻止甘油解逆反应。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆一级油 黑龙江龙江福粮油有限公司提供；甘油 分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；Lipozyme RMIMNovo公司；甘油酯标准品 Sigma Chemical Company；4A型分子筛 中国医药（集团）上海化学试剂公司；乙醚、石油醚、甲酸、氯仿、碘、正己烷、异丙醇等 均为分析纯。

恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；高压反应釜 由青岛科技大学于世涛教授提供；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪高科仪器厂；LD4-2A低速离心机 北京医用离心机厂；HPLC Waters公司。

1.2 酶催化甘油解反应过程

将大豆一级油和经分子筛脱水后的甘油以一定的摩尔比加入到150mL不锈钢高压釜中，添加一定量的脂肪酶Lipozyme RMIM快速搅拌，加入微量的水，密封高压釜，通入CO2进行试漏，再用CO2置换不锈钢高压釜中的空气。置换完成后，在室温条件下充入CO2，使压力达7.5MPa，将反应釜置于集热式恒温加热磁力搅拌器中加热，调节一定的转速，恒温反应一段时间。反应结束后，将不锈钢高压釜冷却至室温，放出气体，打开高压釜，取出流体物，用离心机离心分离除去催化剂，得反应产物，取反应产物进行液相测定，得出甘油二酯百分含量。反应装置系统示意图如图1。

图1 反应装置系统示意图

1.3 甘油二酯含量计算

取反应产物一滴，准确称量，用1mL正己烷/异丙醇50∶1（V/V）溶解，进样分析。色谱条件：检测器：Waters 2410示差折光检测器；主机泵：Waters 515 HPLC Pump；色谱柱：No-va-Pak 3.9mm×150mm液相色谱柱；流动相：正己烷/异丙醇为50∶1（V/V）；流速：1.0mL/min；柱箱温度：35℃；检测器温度：35℃；进样量：20μL。

各种组分的计算采用面积归一法。

式中：w为甘二酯的质量分数；m（FFA）、m（MAG）、m（DAG）和m（TAG）分别为脂肪酸、甘一酯、甘二酯和甘三酯的质量。

2 结果与分析

2.1 反应温度对产物组成变化的影响

反应条件：底物摩尔比2∶1，甘油含水量1%，时间8h，加酶量3%，搅拌速度120r/min。研究表明，反应温度增加，有助于甘油解的提高；但反应温度过高，对酶的空间结构和构象有一定的影响，会降低酶活并减少酶的使用寿命，导致酶的反应速度不是增大反而减小[10]。

图2 反应温度对反应体系各组分百分比的影响

由图2可见，在体系温度约为65℃时，甘二酯含量较高，说明此温度较适合甘油解反应，因此该种酶反应较合适的温度为65℃。

2.2 加酶量对产物组成变化的影响

反应条件：底物摩尔比2∶1，甘油含水量1%，时间8h，温度65℃，搅拌速度120r/min。加酶量的变化和反应速度密切相关，酶量增加，甘油解的速度加快。酶促甘油解过程是一个动力学平衡过程，加酶量的多少只对反应的速度有影响，即对反应达到平衡的时间有影响，而和反应达到平衡的状态没有关系。

图3 酶添加量对反应体系中各组分百分比的影响

由图3可见，3%的加酶量对甘油解反应较为合适，在尽可能降低生产成本的同时，也保证了一定的反应速度。

2.3 底物比对产物组成变化的影响

反应条件：甘油含水量1%，加酶量3%，温度65℃，时间8h，搅拌速度120r/min。

图4 底物摩尔比对反应体系中各组分百分比的影响

底物比不仅影响反应时间也影响平衡状态。由图4可见，当底物比为2∶1时，甘二酯的百分含量达到最大值。在此以后，体系中甘二酯含量呈下降趋势。因此，选择底物比为2∶1。

2.4 甘油含水量对产物组成变化的影响

反应条件：底物摩尔比2∶1，加酶量3%，时间8h，温度65℃，搅拌速度120r/min。对于酶基本水的测定和估算是比较困难的。水量增加时，使酶分子表面的水膜加厚，而反应底物油脂是难溶于水的，因此使底物从主体溶剂扩散到活性部位的阻力增大，不易于底物与酶的结合。

图5 含水量对反应体系中各组分百分比的影响

由图5可见，甘油含水量为1%时，甘二酯百分比最高；随着含水量的增加，甘二酯的百分比呈下降趋势，说明甘油含水量的增加，体系的水解反应速度加快。因此，选择甘油含水量为1%。

2.5 反应时间对产物组成变化的影响

反应条件：底物摩尔比2∶1，甘油含水量1%，加酶量3%，温度65℃，搅拌速度120r/min。脂肪酶所催化的甘油解反应可分为两步完成，在脂肪酶的催化作用下，甘三酯与甘油先醇解为甘一酯和甘二酯（由于酶中有活性水使甘三酯部分水解生成甘二酯、甘一酯和脂肪酸），然后甘一酯和甘三酯再酯交换为甘二酯[11]。

图6 反应时间对体系中各组分百分比的影响

由图6可见，在反应时间为7h以上时，体系中甘二酯含量较高。反应时间的延长不利于经济效益，因此，选择反应时间为7h。

2.6 搅拌速度对产物组成变化的影响

反应条件：底物摩尔比2∶1，甘油含水量1%，加酶量3%，温度65℃，时间8h。适当的搅拌速度会影响多相反应的传质效果，增加底物两相在催化剂表面上的接触，加快反应速度。

由图7可见，在反应速度为120r/min时，甘二酯含量最高；当反应速度继续增加时，甘二酯含量降低，过高的反应速度可能会对固定化酶造成机械损伤，影响酶活。因此，120r/min的搅拌速度较为适合。

图7 搅拌速度对体系中各组分百分比的影响

2.7 正交实验

单因素实验表明，时间和搅拌速度两因素在一定范围内对实验结果的影响不大，反应时间的延长对于产品生产周期、产品质量不利，搅拌速度应选用脂肪酶的最适作用速度即可。所以优化实验中选择反应时间为7h，搅拌速度为120r/min，采用L9（34）正交表进行正交实验，确定最优底物摩尔比、含水量、温度、加酶量等反应条件，以得到甘二酯含量较高的成品油。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验结果

从正交表中R值可知，影响体系生成甘二酯含量的顺序为：加酶量＞底物摩尔比＞温度＞加水量。在选择加酶量时，由k值可看出，k1＜k2，差值较小，由于酶的价格较贵，考虑到工业生产成本的问题，取k1较适合。同时，在选择加水量时也可从k值看出，加少量水与不加水对实验结果影响不大。因此，选择最优实验条件为A2B1C2D2。

2.8 反应产物检测

在最优条件下，CO2超临界体系酶法催化甘油解反应产物色谱图如图8。保留时间在1.923、2.173、2.532、2.898、3.923、11.940min的组分分别是溶剂、甘三酯、脂肪酸、1，3-甘二酯、1，2-甘二酯、单甘脂。

图8 反应产物色谱图

3 结论

3.1 本研究确定了在CO2超临界体系中以大豆一级油和甘油为原料，研究以固定化脂肪酶Lipozyme RMIM催化甘油解反应合成甘油二酯的工艺是可行的。通过单因素与正交实验，确定了最佳工艺条件为：大豆一级油与甘油摩尔比2∶1，反应温度65℃，加酶量2.5%，甘油含水量1%，反应时间7h，搅拌速度120r/min。在此条件下，得反应产物中甘油二酯含量为70.2%，其中1，3-甘油二酯含量达56.2%。

3.2 常规的甘油解生成甘油二酯含量63%左右，1，3-甘油二酯含量50%左右。CO2超临界体系甘油解与常规甘油解相比，甘油二酯含量要高出7%左右，其中1，3-甘油二酯含量要高出5%左右，并且时间减少了2h左右。

3.3 采用超临界体系具有的优势在于粘度低、溶解性高。超临界状态下流体二氧化碳同时起到溶剂和催化剂的作用，由于CO2是非极性分子，可避免其它方法出现中毒和催化剂失活的现象。另外，重要的是在该反应环境下可阻止甘油解逆反应，从而提高了甘油二酯的含量。

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[11]邱寿宽.酶促大豆油甘油解制备甘二酯的研究[D].郑州：郑州工程学院，2003.

Study on enzymatic synthesis of diacylglycerol by glycerolysis in supercritical system

REN Yun-hong,SUN Bo,LIU Jing,JIANG Lian-zhou,YU Dian-yu*

（School of Food Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The preparation of DG by enzymatic glycerolysis in the CO2supercritical system was studied.The effect of substrate soybean oil/glycerin molar ratio，temperature，amount of enzyme，water content of glycerol，time and stirring speed on the preparation of DG were studied.Through the single factor and orthogonal tests，the optimum conditions were determined as follows:ubstrate molar ratio 2∶1， temperature 65℃ ， amount of enzyme 2.5%，water content of glycerol 1%，time 7h，stirring speed 120r/min.The product content of DG were 70.2%，of which 1，3-DG were 56.2%.Compared with the conventional glycerolysis，the content of DG were much more than 7%，of which 1，3-DG were much more than 5%，and time reduced about two hours.

soybean oil； glycerolysis； lipase Lipozyme RMIM； CO2supercritical； diacylglycerol

TS201.1

B

1002-0306（2011）10-0337-04

2010－10－26 * 通讯联系人

任运宏（1959-），男，高级实验师，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

国家863高技术研究发展计划（2010AA101503）。