西藏开菲尔中抑菌活性物质的提取及抑菌效果研究

黄曼曼，陈雪香，肖苏尧，林健辉，黄伟华，曹 庸

（华南农业大学食品学院，广东广州 510640）

西藏开菲尔中抑菌活性物质的提取及抑菌效果研究

黄曼曼，陈雪香，肖苏尧，林健辉，黄伟华，曹 庸﹡

（华南农业大学食品学院，广东广州 510640）

采用水提取西藏开菲尔（Kefir）中的抑菌活性成分，用K-B纸片法测定提取物对常见的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、部分真菌和霉菌的抑菌活性，并检测了用不同的pH、温度、光照处理后提取物的抑菌效果。研究结果表明，Kefir提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌、黄曲霉和啤酒酵母均有明显的抑制效果，最小抑菌浓度（MIC）在6.25～12.5mg/mL之间，与尼生素相比，抑菌效果相当，抑菌谱更广；提取物在酸性和中性条件下抑菌活性稳定，而在碱性条件下抑菌活性减弱，且具有较好的热稳定性和光稳定性。

西藏开菲尔，提取物，抑菌效果

Kefir是以由多种微生物组成的开菲尔粒作为发酵剂，发酵乳品而成的饮料，开菲尔粒的复杂共生体使得其具有丰富的营养价值和特殊的保健特性[1]。Kefir的研究始于20世纪九十年代。研究证明，不同地区的开菲尔，由于其发酵开菲尔粒菌相不同，其产物和特性也有不同[4]。西藏Kefir（藏灵菇）是我国西藏地区人民常年大量饮用的一种发酵饮品，不需进行低温及防腐处理，与市售发酵乳的保存方式相差很大。周剑忠等[5]研究了西藏Kefir的发酵特性；刘慧等[6]研究了藏灵菇中嗜热链球菌高产胞外多糖；陶应龙等[7]发现服用藏灵菇培养液对高脂血症患者血脂中的胆固醇有一定的降低作用；李永奇[8]等证明了西藏Kefir对治疗慢性肠道疾病有一定的调节作用；Simova等[2]通过提取、分离、纯化手段从Kefir中提取到高效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等微生物的小分子抑菌多肽；Sarkar等证明了Kefir提取物对伤口愈合的作用大于新霉素[3]。上述研究表明，西藏Kefir具有良好的保健和治疗慢性肠道疾病和降低胆固醇的作用，但国内外目前只对其微生物菌群及其发酵特性研究较多，而对其抑菌物质基础及其抑菌机理研究鲜见报道。本文采用水提取西藏Kefir抑菌成分，以常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌为受试菌进行抑菌活性检测，初步研究了其提取物的抑菌效果，为进一步研究开菲尔中抑菌活性成分的分离纯化、抑菌物质基础及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

开菲尔粒 采集于西藏；供试菌种：啤酒酵母菌（Sac-charomycescerevisiae）、大肠杆菌（Escherichiacol）i、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）、霉菌（Aflatoxin），以上菌种均为食品学院微生物实验室保藏；培养基 牛肉浸膏蛋白胨培养基，察氏培养基；试剂 均为分析纯；奶粉 市售，伊利学生营养奶粉。

R201BL型旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；FD-1PF型立式冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司；TDL-5型台式离心机 上海安亭科技仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 Kefir发酵液的制备[9]开菲尔粒用无菌水冲洗后，按2%（W/V）的比例接种到奶粉配制的牛奶（20%）中，30℃培养24h，滤出Kefir粒，得Kefir发酵液。1.2.2 Kefir中活性成分的提取 将Kefir发酵液在4000r/min条件下离心30min，取上清液，沉淀用等体积的蒸馏水室温提取2h，离心，取上清液，合并上清液，在40～50℃浓缩，冻干备用。

1.2.3 K-B纸片法测定提取物抑菌活性[11]取一定浓度的提取物溶液0.2mL放入20片6mm圆形灭菌滤纸片，充分浸泡后40℃烘干待用。供试菌种采用平板活化，取活化后的菌种用生理盐水配成1.5×106cfu/mL的菌悬液，并分别取待试菌悬液0.2mL以涂布法制成菌平板，每块平板内等距离放入滤纸片。置于适宜温度下培养、观察，并测定抑菌圈直径，以生理盐水作为阴性对照，浓度为50mg/mL的尼生素溶液作为阳性对照。

1.2.4 提取物在不同温度条件下处理及抑菌效果比较 将Kefir提取物用蒸馏水配制成50mg/mL的溶液。分别取1mL置于编号的实验瓶，分别置于60、80、100、110℃中处理时间为10、20min。以未处理为对照，用K-B纸片法测试其抑菌效果。

1.2.5 提取物在不同pH条件下处理及抑菌效果比较[12]

将Kefir上清提取物配制成50mg/mL的溶液。用稀盐酸或氨水调节提取物溶液pH分别为2、3、4、5、7、8、9、11，以未处理溶液为对照，用K-B纸片法测试其抑菌效果。

1.2.6 提取物在不同光照条件处理及抑菌效果比较[13]将Kefir提取物配制成50mg/mL的溶液，分别放在避光、自然光、日光、紫外光（130W）下处理12h，用K-B纸片法测试其抑菌效果。

1.2.7 提取物最低抑菌浓度的确定 将提取物配制一定浓度的溶液，采用试管连续二倍稀释法[14]分别配成浓度为50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78mg/mL，然后每管加入0.1mL浓度为1.5×106cfu/mL的菌悬液，置恒温培养。结果判定:肉汤清亮透明表示无细菌生长（-），肉汤浑浊表示有细菌生长（+），以能抑制细菌生长的Kefir提取物最高稀释度作为其最低抑菌浓度，以无菌水作对照。

2 结果与讨论

2.1 Kefir初提物的抑菌活性

经过多次重复性实验后表明：Kefir提取物对痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黄曲霉菌均有抑制作用，啤酒酵母菌的抑制作用最强，抑菌圈达到11.6mm，尼生素对黄曲霉和啤酒酵母无抑菌效果，Kefir初提物对这两种菌抑菌效果明显。根据几种供试菌的抑菌效果，选取金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作为后继活性研究供试菌（见表1）。

表1 两种不同提取物的抑菌效果（抑菌圈直径，mm）

2.2 Kefir提取物经不同温度处理后的抑菌效果比较

Kefir提取物经60、80、100、110℃等不同温度处理20min后，对各种实验菌的抑菌活性与常温相比无明显变化，这说明Kefir初提取物的抑菌活性成分对热较稳定，在短时间内能耐较高温度（见表2）。

表2 热处理Kefir提取物的抑菌活性（抑菌圈直径，mm）

表3 Kefir提取物经不同pH处理后的抑菌效果（抑菌圈直径，mm）

2.3 Kefir提取物经不同pH处理后的抑菌效果比较

Kefir提取物经不同pH处理后，pH为1.0～7.0，提取物的抑菌作用随着pH的提高而降低，在pH为5.0～7.0的抑菌作用大幅度降低：当pH在8.0～11.0时，提取物对三种指示菌的抑制作用完全消失，由此说明Kefir抑菌活性成分在pH在1.0～7.0较稳定，其抑菌效果较好（见表3）。研究结果表明Kefir提取物中的活性成分在酸性环境下较稳定。

2.4 Kefir提取物经不同光照处理后的抑菌效果比较

Kefir提取物经日光、太阳光和紫外光等光照处理后，其抑菌圈直径无明显变化，说明Kefir提取物的抑菌活性成分在24h内对光照较稳定，不同光质对Kefir抑菌活性物质的影响也较小（见表4），说明Kefir提取物在日光、太阳光和紫外光处理24h较稳定。

表4 提取物受光抑菌实验

2.5 Kefir提取物最小抑菌浓度的测定

通过试管连续二倍稀释法检测上清提取物的最低抑菌浓度，测定结果表明：Kefir提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度约为12.5mg/mL，对痢疾志贺氏菌的最低抑菌浓度为6.25mg/mL，对啤酒酵母和黄曲霉菌的最低抑菌浓度约为12.5mg/mL（见表5）。结果表明：Kefir提取物在较低的浓度下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和黄曲霉菌均有明显的抑制效果。

表5 Kefir提取物的最小抑菌浓度（MIC）

3 结论与讨论

通过本文的研究可知：Kefir提取物可以抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，对部分真菌（酵母和黄曲霉）也有明显的抑制效果，具有显著的抑菌效果且抑菌谱较广泛。提取物抑菌活性成分对热（110℃）、不同光质和酸较稳定。有关天然食品添加剂的使用，Nisin是最早用于食品，现在被广泛用于乳制品、肉制品、植物蛋白食品、罐头食品的防腐保鲜的天然防腐剂[16]。2009年新颁布的GB-2760，天然防腐剂尼生素和纳他霉素均在册，国外业已广泛应用细菌抑菌蛋白作为安全的食品保藏剂（如防腐或抑菌），但是尼生素只能抑制革兰氏阴性菌和部分阳性菌[17]，纳他霉素也只对真菌有抑制效果，存在抑菌谱窄、价格昂贵等不足。西藏Kefir作为一种传统饮料，从中提取获得的抑菌活性物质具有良好的生物安全性。实验结果显示其抑菌活性物质具有耐高温（110℃）及抑菌效果好、抑菌谱广的特性，因此有必要对其中的活性成分作进一步深入研究，以期研究清楚其抑菌物质基础。

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Research on the antibacterial activity of substances extracted from Tibet Kefir

HUANG Man-man,CHEN Xue-xiang,XIAO Su-yao,LIN Jian-hui,HUANG Wei-hua,CAO Yong*

（College of Food Science,South China University of Agricultural,Guangzhou 510640,China）

Active constituents in Kefir were extracted by water，the antibiosis activity on Escherichia coli，Staphylococcus aureus Rosen Bach，Bacillus subtilis，Shigella dysenteries，Sac-charomyces cerevisiae and Aflatoxin was studied by K-B slips.The extracts were treated with different pH，temperature，lights，then bacteriostasis was studied.The results showed that extracted antibacterial substance had shown antibiosis on Gram positive bacteria and Gram negative bacteria and parts of epiphyte.The minimum fungicide concentration of extracts was 6.25～12.5mg/mL.Compared with nisin，the antibiosis activity was limited，and more organisms spectrum.Antibacterial substance had good stability to hot，acidity and light.

Tibet Kefir； extract； antibiosis

TS201.1

A

1002-0306（2011）10-0159-03

2010-10-11 *通讯联系人

黄曼曼（1986-），女，硕士研究生，研究方向：食品化学与营养。