甲壳素超微粉碎辅助制备D-氨基葡萄糖盐酸盐

朱兴一，张玉燕，谢 捷，王 平

(浙江工业大学药学院，制药工程教育部重点实验室，浙江杭州 310014)

甲壳素超微粉碎辅助制备D-氨基葡萄糖盐酸盐

朱兴一，张玉燕，谢 捷，王 平*

(浙江工业大学药学院，制药工程教育部重点实验室，浙江杭州 310014)

研究了甲壳素超微粉碎辅助制备D－氨基葡萄糖盐酸盐(GAH)的工艺。对HCl浓度、反应时间、反应温度和液料比进行单因素考察，根据考察结果进行Box－Benhnken中心组合设计，利用响应面分析法优化工艺参数，然后进行验证实验，并将该工艺条件与传统GAH制备工艺比较。结果表明，甲壳素超微粉碎辅助制备GAH的较佳工艺为:HCl浓度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反应时间3.6h、反应温度83.0℃。此条件下GAH得率为74.82%，与理论值基本相符。与传统制备工艺相比，新工艺反应条件更加温和，同时GAH得率提高了14.77%。

甲壳素，超微粉碎，D－氨基葡萄糖盐酸盐(GAH)，响应面分析

甲壳素是一种自然界大量存在的可再生的天然生物高分子聚合物，主要组成单位是N－乙酰－D－氨基葡萄糖。在盐酸中，甲壳素水解生成D－氨基葡萄糖盐酸盐(D－Glucosamine hydrochloride，GAH)。GAH性质稳定，具有抗炎、抗氧化、防腐、抗菌、抗肿瘤等多种作用，同时也是合成有关药物的重要原料，广泛应用于医药、食品、化工等领域［1－4］，其需求量日益增加。超微粉碎技术是为适应现代技术要求而发展起来的一种新的粉碎技术，能把原材料加工成微米甚至纳米级的微粉。经超微粉碎的物料，具有一般颗粒所不具有的特殊理化性质，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等［5－7］。超微粉碎技术被广泛应用到食品、中药、农产品等领域中［8－11］，其发展前景广阔。本文探讨甲壳素超微粉碎辅助制备GAH的工艺，通过单因素考察和响应面分析，确定较佳工艺条件，并与传统GAH制备方法进行比较，以期提供一种高效制备GAH的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲壳素 片状，浙江新复大医药化工有限公司;浓盐酸、无水乙醇 分析纯;粉末状活性炭 化学纯。

DZF真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;RE－52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂; AGO－2型高能行星球磨机 俄罗斯;WZZ－1旋光仪

上海物理光学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 GAH制备工艺

1.2.1.1 甲壳素超微粉碎辅助制备GAH工艺 取甲壳素原料用AGO－2球磨机进行超微粉碎，过500目筛得到粒径≤0.025mm的超微粉。准确称取甲壳素超微粉20.0g，缓慢投入装有一定浓度HCl溶液的烧瓶中，搅拌条件下缓慢升温至设定的温度，水解反应若干小时。反应结束后，过滤，滤液用活性炭脱色，再经减压浓缩、无水乙醇洗涤、70℃干燥得GAH白色晶体。计算产品得率，测定旋光度。

1.2.1.2 传统制备GAH工艺 准确称取甲壳素原料

20.0g，缓慢投入装有一定浓度HCl溶液的烧瓶中，后续操作过程同前。

1.2.2 GAH得率计算 GAH得率按如下公式计算∶

式中∶m－产品GAH质量(g);M－甲壳素质量(g)。

1.2.3 旋光度测定 准确称取0.25g GAH产品，用蒸馏水配制成25mL溶液，20℃下放置10h后，在WZZ－1旋光仪上测定旋光度，计算其比旋光度。

1.2.4 实验方案的设计

1.2.4.1 单因素实验 通过预实验，确定对HCl浓度、反应时间、反应温度和液料比进行单因素实验。

1.2.4.2 响应面优化实验 依据单因素实验结果，采用Design Expert 7.0软件建立响应面分析模型，以HCl浓度(X1)、液料比(X2)、反应时间(X3)、反应温度(X4)为自变量，以+1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平，GAH的得率(Y)为响应值，设计四因素三水平实验。实验因素与水平的取值见表1。

表1 响应面分析因素与水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验及结果

2.1.1 HCl浓度对GAH得率的影响 固定HCl溶液与甲壳素液料比为4∶1(mL∶g)，反应时间为4h，反应温度为90℃，改变HCl浓度，GAH得率见图1。由图1可以看出，当HCl浓度低于6mol/L时，产品得率较低，这是由于低浓度HCl难以水解β－(1，4)糖苷键。随着HCl浓度的升高，水解能力逐渐增强，GAH得率增加。当HCl浓度为8mol/L时，GAH得率最高。HCl浓度继续增加时，GAH得率开始下降，这是因为HCl浓度过高，副反应增多，焦化现象严重。响应面中心组合实验选取HCl浓度范围为6～10mol/L。

2.1.2 HCl溶液与甲壳素液料比对GAH得率的影响

固定HCl浓度为8mol/L，反应时间为4h，反应温度为90℃，改变HCl溶液与甲壳素的液料比，结果见图2。液料比低，反应体系黏度增大，反应不充分。液料比提高，甲壳素可充分反应，但用量过多时会出现副反应，GAH得率下降。响应面中心组合实验选取液料比范围为3∶1～5∶1(mL∶g)。

图1HCl浓度对GAH得率的影响

图2 液料比对GAH得率的影响

2.1.3 反应时间对GAH得率的影响 固定HCl浓度8mol/L，HCl溶液与甲壳素液料比为4∶1(mL∶g)，反应温度为80℃，改变反应时间，结果见图3。随着反应时间延长，GAH得率逐渐提高，当反应达到4h时，得率达到最大值72.23%。时间过短，甲壳素水解不完全，时间过长，副反应严重。响应面中心组合实验选取反应时间范围为3～5h。

图3 反应时间对GAH得率的影响

2.1.4 反应温度对GAH得率的影响 固定HCl浓度为8mol/L，HCl与甲壳素液料比为4∶1(mL∶g)，反应时间为4h，改变反应温度，GAH得率见图4。由图

4可以看出，随着温度升高，GAH得率增加，当温度高于80℃时，GAH得率开始下降。温度较低时，甲壳素不反应，温度过高时，易生成低聚糖与非糖物质等副产物，同时产品颜色加深，因而应避免高温，以提高GAH的得率与纯度。响应面中心组合实验选取温度范围为70～90℃。

图4 反应温度对GAH得率的影响

2.2 响应面分析实验及结果

根据Box－Benhnken实验设计原理，综合单因素实验结果，通过Design Expert 7.0软件，对制备工艺进行响应面分析，建立数学模型，按方程xi=(Xi－X0)/ΔX对自变量进行编码，共设立了29个处理组。其中，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长。实验设计与实验结果如表2所示。各因素经回归拟合后，得二次多项回归方程为∶

表2 Box－Benhnken设计方案及实验结果

当“Prob＞F”值小于0.05时表示该指标显著。从表3的分析结果来看，整体模型“Prob＞F”值小于0.0001，表明该二次方程模型高度显著。R2=0.9840表明模型响应值的变化98.40%来自所选因变量，预测值与实测值之间具有高度的相关性。模型的失拟性方差分析可以看出，失拟项不显著(P＞0.05)，表明该模型是稳定的，能很好地预测实际GAH得率的变化。由表3的F值可知，在所选的各因素水平范围内，各因素对GAH得率的影响顺序为∶HCl浓度＞反应温度＞液料比＞反应时间。根据回归分析结果，得到相应的曲面图(图5～图10)。图5～图10直观地给出了各个因素交互作用的响应面的3D图和等高线图。从响应面的最高点和等高线图可以看出，在所选的范围内存在极值，即是响应面的最高点。等高线图直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著。比较几个图可以知道，HCl浓度、反应温度对响应值的影响较大，表现为曲线比较陡，这与回归分析的结果吻合。

表3 回归模型方差分析结果

2.3 响应面分析结果验证

结合回归模型的数学分析可知，甲壳素超微粉碎辅助制备GAH的较佳工艺参数为∶HCl浓度8.76 mol/L、液料比4.14∶1(mL∶g)、反应时间3.55h、反应温度82.9℃。为了检验响应面法的可行性，对回归得到的较佳工艺进行验证实验。考虑到实际操作的可行性，将较佳工艺条件定为∶HCl浓度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反应时间3.6h、反应温度83.0℃。实验重复3次，GAH平均得率为74.82%，与预测值的相对误差为1%左右。所得产品比旋光度为71.2～72.6°，符合质量标准要求(美国药典∶+70.0～+73.0°)。由此说明，响应面法适用于GAH制备工艺的回归分析和参数优化，具有一定的实用价值。

2.4 甲壳素超微粉碎辅助制备工艺与传统制备工艺比较实验

对传统GAH制备进行响应面分析法实验设计后，得到较佳工艺条件∶HCl浓度10.4 mol/L、液料比4.8∶1(mL∶g)、反应时间4.4h、反应温度90.2℃。将此工艺与甲壳素超微粉碎辅助制备的较佳工艺进行比较，结果见表4。

表4 微粉碎辅助制备工艺与传统酸法制备工艺比较

由表4可知，与传统工艺相比，甲壳素超微粉碎辅助制备工艺降低了HCl浓度、用量及反应温度，同时缩短了反应时间，GAH得率提高了14.77%，这是

图5 HCl浓度和液料比对GAH得率影响的响应面图

图6 HCl浓度和反应时间对GAH得率影响的响应面图

图7 HCl浓度和反应温度对GAH得率影响的响应面图

图8 液料比和反应时间对GAH得率影响的响应面图

图9 液料比和反应温度GAH得率影响的响应面图甲壳素超微粉碎的特殊作用所致。通过超微粉碎，降低了原料的粉末粒径，同时增大了表面积，使甲壳素更易于和HCl接触，从而使反应能在较温和的条件下进行，避免了因长时间高温作用引起过度反应形成的焦化现象，保证了产品的高得率和高纯度。

图10 反应温度和反应时间对GAH得率影响的响应面图

3 结论

研究了甲壳素超微粉碎辅助制备GAH的工艺，并用响应面分析法优化得到较佳工艺参数∶HCl浓度8.8mol/L、液料比4.2∶1(mL∶g)、反应时间3.6h、反应温度83.0℃。此时，GAH的得率为74.82%，与理论值基本相符。与传统制备工艺相比，新工艺反应条件更加温和，同时GAH得率明显提高，为GAH生产工艺的改进起到了一定的参考作用。

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Superfine comminution assisted preparation of D－Glucosamine hydrochloride from chitin

ZHU Xing－yi，ZHANG Yu－yan，XIE Jie，WANG Ping*
(College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang University of Technology，Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering of Ministry of Education，Hangzhou 310014，China)

The operating factors affecting the yield of D－Glucosamine hydrochloride(GAH)from chitin by superfine comminution assisted preparation(SCAP)were studied.Firstly，single factors including HCl concentration，solidliquid ratio，reaction time and reaction temperature were investigated seperately，then the response surface analysis method followed by the verification tests was conducted for obtaining the appropriate operation conditions.Finally，the SCAP method was compared with the traditional preparation method.Results showed that the optimal conditions of GAH preparation were as follow:HCl concentration was 8.8mol/L，liquid－solid ratio was 4.2∶1 (mL∶g)，reaction time was 3.6h and reaction temperature was 83.0℃.Under above conditions，the yield of GAH was 74.82%，which matched with the predicted yield.Compared with the traditional preparation method，the SCAP method had obvious advantages with milder conditions and higher yield.

chitin;superfine comminution;D－Glucosamine hydrochloride(GAH);response surface analysis

TS201.2

B

1002－0306(2011)11－0321－04

2010－09－21 *通讯联系人

朱兴一(1977－)，男，讲师，博士，主要从事天然药物研究。

浙江省教育厅科研计划项目(Y200908144);科技部国际科技合作项目(2008DFR40280)。