毛豆腐的毛霉发酵与其提取物的体外ACE抑制活性

杭 梅，赵新淮

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

毛豆腐的毛霉发酵与其提取物的体外ACE抑制活性

杭 梅，赵新淮*

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

利用分离得到的1株毛霉发酵豆腐制备毛豆腐。采用20%、40%、60%(v/v)乙醇溶液作为提取溶剂，对发酵时间为3、5、7、9d的毛豆腐样品进行提取，测定提取物中可溶性蛋白质的提取率、水解度，以及提取物的体外ACE抑制活性。研究结果表明，随着毛豆腐发酵时间的延长，提取物中可溶性蛋白质提取率、水解度逐渐增加;毛豆腐发酵第5d时，60%(v/v)乙醇溶液提取物的ACE抑制活性最高，并且其氨基酸组成分析结果表明，60%(v/v)乙醇溶液提取物中总疏水性氨基酸和脯氨酸的量最多。

毛霉，毛豆腐，乙醇提取物，ACE抑制活性

近年来，人们对具有预防或治疗某些疾病的食品成分产生了兴趣［1－2］。大豆发酵制品具有某些较好的生理功能，诸如抗癌、抗氧化、抗菌和降血压等［3］。大豆发酵制品的降血压功能，主要源于其中所含有的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽，这类肽已从许多大豆制品中提取并被研究［1，4－5］。毛豆腐是我国徽州的著名小吃［6］，是利用微生物发酵豆腐所制成的发酵食品，可以有效地提高大豆的消化率和生物价［7］。毛霉是生产毛豆腐的主要菌种。毛霉能分泌蛋白酶，将蛋白质分解生成氨基酸和多肽等，使食品具有独特的风味和细腻的质地。毛豆腐的制作工艺与腐乳相似，而关于腐乳的降血压功能已有多个研究报告。已有研究者研究日本腐乳和中国腐乳的ACE抑制活性［8－9］。倪莉认为，在腐乳的水溶性成分中含有ACE抑制活性肽［10］。我们曾经研究过毛豆腐发酵过程中主要成分、微细结构等的变化［11］，并确定了毛霉产蛋白酶的适宜发酵条件［12］，并未评价毛豆腐中蛋白质的生物活性，不能确定毛霉发酵是否能够使得毛豆腐提取物具有ACE抑制作用。为此，根据过去的工作基础，本研究利用以前分离得到的1株毛霉菌种，实验室发酵制备毛豆腐样品，然后利用3种组成比例不同的乙醇水溶液为提取剂，对发酵时间不同的毛豆腐样品分别进行提取，分析各种提取物中蛋白质组分的含量及其水解度大小，然后测定其体外的ACE抑制活性，最后对具有最高活性的提取物进行氨基酸组成分析。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

豆腐 购自哈尔滨市市场;毛霉(Mucor) 从民间自然发酵生产的毛豆腐中分离获得;兔肺丙酮粉、FAPGG(FA－Phe－Gly－Gly) Sigma公司;其它所用试剂为分析纯试剂，所用水为蒸馏水。

UV－2401PC型紫外可见分光光度计 日本岛津公司;AL204型分析天平 梅特勒－托利多仪器中国有限公司;Kjeltec TM2300型自动凯氏定氮仪 瑞士Foss公司;DHP－9272型电热恒温培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司;手提式压力蒸汽灭菌器

镇海金鑫医疗器械有限公司;H－1型微型漩涡混合器、DS－1高速组织捣碎机 上海精科实业有限公司;YH－4BS型远红外恒温干燥箱 天津市中环实验电炉有限公司;DK－98－1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 毛豆腐制作 取市售的豆腐，将豆腐切块为6cm×6cm×4cm大小，121℃灭菌30min后，稍风干除去水滴，然后摆放在竹笼内，豆腐块之间应保持一定距离，以利于发酵。

预先将毛霉制成菌悬液，用毛刷将菌悬液均匀涂于各表面，用纱布将竹笼覆盖好后送入培养箱。

培养箱温度控制在20℃。发酵过程中，豆腐表面出现白色绒毛并形成菌膜;发酵后期豆腐软化并有毛豆腐特有的香气。在发酵时间为3、5、7、9d时，随机取出若干样品，进行提取与分析。

1.2.2 毛豆腐水分与总蛋白质的测定

1.2.2.1 水分测定 采用 105℃烘干法［13］。平行3次。

1.2.2.2 总蛋白质测定 采用凯氏定氮法［14］。将毛豆腐样品在121℃灭酶30min，取出冷却，除去菌膜后用高速组织捣碎机捣碎。取一定质量的样品进行凯氏定氮分析，计算总蛋白质含量，换算系数为5.71。平行3次。

1.2.3 毛豆腐的提取及蛋白质提取率测定 取75g毛豆腐，分别与20%、40%、60%(v/v)乙醇溶液混合，定容到250mL，高速组织捣碎机中12000r/min捣碎1.5min，离心机中5000r/min离心15min，分离上清液得到毛豆腐提取物。提取物中的乙醇通过旋转蒸发除去，然后定容至原体积。各个提取物和毛豆腐样品分别进行凯氏定氮分析，计算蛋白质提取率。平行3次。

1.2.4 提取物的分析方法

1.2.4.1 游离氨基含量与蛋白质水解度 蛋白质含量测定参照凯氏定氮法［14］。提取物游离氨基含量与蛋白质水解度(DH)测定参照OPA法［15－16］。

水解度计算公式如下∶

DH(%)=［提取物游离氨基含量(μmol/mL)/ 5.71×N1(mg/mL)－0.35(mmol/g)］/7.8(mmol/g) ×100%

式中∶5.71，大豆蛋白质的换算系数;0.35mmol/g，大豆蛋白质的游离氨基含量;7.8mmol/g，大豆蛋白质的肽键含量;N1，提取物的氮含量，mg/mL。

1.2.4.2 ACE抑制活性 以FAPGG为底物，采用非连续分光光度法测定样品的ACE抑制活性［17－18］。

ACE酶液∶称取50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4℃的硼酸缓冲溶液(pH 8.3，100mmol/L)中，悬液放入4℃恒温震荡摇床中提取12h，20000r/min冷冻离心20min，上清液于4℃低温保存。

FAPGG底物溶液∶将 FAPGG溶于100mmol/L的硼酸缓冲溶液(pH8.3，含300mmol/L的NaCl)，配制成1.6mmol/L的溶液。

ACE抑制活性测定∶500μL FAPGG底物溶液与100μL超纯水或提取物混匀，37℃预热 2min，加300μL ACE酶液并在37℃反应30min，立即加100μL EDTA(100mmol/L)终止反应;加4000μL超纯水稀释，平行3次。0min样品的测定，先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。分光光度计340nm处波长分别测体系在0min和30min时的吸光值，计算差值ΔA(ΔA=A0min－A30min)。以单位时间内吸光值变化表示ACE酶活力，提取物对ACE酶的抑制程度按下式计算∶

式中∶ΔAc，加入超纯水时吸光值在30min内的变化;ΔAi，加入提取物时吸光值在30min内的变化。

1.2.4.3 氨基酸组成分析 采用氨基酸自动分析仪进行分析。

1.3 数据处理

采用SPSS 13.0软件对数据进行处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 毛豆腐发酵过程中主要成分组成的变化

毛豆腐发酵过程中，因为水分的自然蒸发而损失一部分水分(由84.5%降至73.6%)，这样就导致毛豆腐的蛋白质含量随之增加(由 8.1%增至14.3%)。这些变化趋势如图1所示，并与以前的研究结果［11］一致。

图1 毛豆腐毛霉发酵过程中水分与总蛋白质含量变化

2.2 毛豆腐提取物的蛋白质提取率和水解度

毛豆腐在被毛霉发酵不同时间后，利用乙醇浓度不同的3种乙醇溶液提取其中的可溶性蛋白质组分。所提取出的蛋白质组分的提取率和水解度如表1所示。数据表明，随着毛霉发酵时间的延长，毛豆腐提取物中蛋白质的提取率与水解度均呈现增加的趋势，尤其是蛋白质组分的提取率从6.0%以下增加至31%以上。这说明发酵过程中毛霉所分泌的蛋白酶，充分地降解了豆腐中的大豆蛋白质;发酵时间延长，毛霉分泌蛋白酶的水解作用增加，使其水解度增加，同时也增加了其在提取溶剂中的溶解性，导致可溶性蛋白质的提取率增加。毛豆腐发酵9d时，无论采用何种提取溶剂，可溶性蛋白质的提取率和水解度均最大。

表1 不同发酵时间毛豆腐提取物的可溶性蛋白质提取率和水解度

表2 不同发酵时间毛豆腐提取物的ACE抑制活性(%)

提取溶剂中乙醇含量不同(即极性不同)，影响毛豆腐提取物可溶性蛋白质的提取率与水解度。60%(v/v)乙醇溶液的极性最低，提取物中的可溶性蛋白质最少、提取率最低，但是水解度相对最大。而20%(v/v)乙醇溶液的极性最高，提取物中的可溶性蛋白质最多、提取率最高，但是水解度相对最小。另外，发酵3d后，所有提取物中蛋白质组分的水解度在22%以上，说明蛋白质组分是大豆蛋白的降解产物肽而非大豆蛋白质。

2.3 毛豆腐提取物的ACE抑制活性

对毛豆腐提取物的ACE抑制活性进行测定，固定测定样品的蛋白质浓度为0.5mg/mL，结果如表2所示。数据表明，发酵时间与提取溶剂组成对提取物的ACE抑制活性有影响。在同一发酵时间，60% (v/v)乙醇溶液提取物的 ACE抑制活性最高，而20%(v/v)乙醇溶液提取物的ACE抑制活性最低;从发酵时间的影响来看，发酵第5d时得到的提取物具有最高抑制活性;整体上看，发酵时间为5d、60% (v/v)乙醇溶液提取物具有最高的ACE抑制活性。这些结果表明∶豆腐经过毛霉发酵后，其蛋白质被降解，生成对ACE具有抑制作用的肽，使得毛豆腐提取物对ACE的抑制作用加强。也就是说，毛霉发酵可以赋予豆腐以更好的ACE抑制作用。

2.4 发酵5d的毛豆腐提取物的氨基酸组成

对发酵5d的毛豆腐提取物的17种氨基酸的摩尔数百分组成进行分析，测定、计算出的结果如表3所示。从表3中数据可以看出，60%(v/v)乙醇溶液提取物的总疏水性氨基酸最多(37.00%)，20%(v/v)乙醇溶液提取物的总疏水性氨基酸最少(32.20%)。另外，60%(v/v)乙醇溶液提取物中的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸，尤其是脯氨酸，明显地高于其他提取物。普遍认为疏水性氨基酸在ACE抑制肽中起重要作用。Cheung等人发现，ACE抑制肽的活性主要取决于C端氨基酸，C端氨基酸为芳香族氨基酸和脯氨酸时，其抑制活性较高［19］。另外，Megías等人认为，N端为疏水性的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或碱性氨基酸的肽，与ACE的亲和力较强，所以其抑制活性较高［20］。这些结论支持了表3中的数据和前述的提取物ACE抑制活性差异，即毛豆腐提取物的脯氨酸含量高、总疏水性氨基酸多，其ACE抑制活性就高。

表3 毛豆腐发酵第5d时提取物的氨基酸组成(mol，%)

3 结论

利用1株毛霉对豆腐进行发酵获得毛豆腐，利用3种乙醇溶液(20%、40%、60%，v/v)对发酵时间为3、5、7、9d的毛豆腐样品进行提取，获得可溶性蛋白质提取物。分析表明，提取物中可溶性蛋白质的提取率、水解度均随着发酵时间的增加而增加;60% (v/v)乙醇溶液提取物中的可溶性蛋白质最少、提取率最低、水解度最大，20%(v/v)乙醇溶液提取物中的可溶性蛋白质最多、提取率最高、水解度最小。同时，发酵时间与提取溶剂组成对毛豆腐提取物的ACE抑制活性有影响，发酵时间为5d、60%(v/v)乙醇溶液提取物具有最高的ACE抑制活性，并且氨基酸组成分析结果显示，60%(v/v)乙醇提取物的脯氨酸(Pro)、总疏水性氨基酸最多。豆腐经过毛霉的发酵，赋予其更好的ACE抑制作用。

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Fermentation of Mao－tofu by Mucor spp.and ACE－inhibitory activity of its extracts in vitro

HANG Mei，ZHAO Xin－huai*
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Commercial tofu was fermented with a strain of Mucor to prepare Mao－tufu.Mao－tofu samples fermented for 3，5，7，9 days were extracted by three ethanol solutions with ethanol contraction of 20%，40%and 60%(v/v)，respectively.The extraction yield and degree of hydrolysis of the soluble protein fractions in the extracts were analyzed.The ACE－inhibitory activity of the extracts was also evaluated in vitro.The results showed that the longer the fermentation time of Mao－tofu samples，the higher extraction yield and degree of hydrolysis of the soluble protein fractions in the extracts.When Mao－tofu sample was fermented for 5 days，its extract of 60%(v/v)ethanol solution showed the highest ACE－inhibitory activity.Meanwhile，the amino acid compositions obtained indicated that the extract of 60%(v/v)ethanol solution had the highest amount of total hydrophobic amino acids and proline.

Mucor spp.;Mao－tofu;ethanol extracts;ACE－inhibitory activity

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0187－04

2011－08－01 *通讯联系人

杭梅(1984－)，女，在读硕士研究生，研究方向:食品科学。