荧光衍生化法测定不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量

李继文，郭晓燕，王 腾，李翠清，*

(1.北京化工大学化学工程学院，北京 100029; 2.北京石油化工学院化学工程学院，北京 102617)

荧光衍生化法测定不同季节桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量

李继文1，2，郭晓燕2，王 腾2，李翠清2，*

(1.北京化工大学化学工程学院，北京 100029; 2.北京石油化工学院化学工程学院，北京 102617)

目的:建立测定桑叶中1－脱氧野尻霉素(1－DNJ)含量的方法，并比较不同季节桑叶中1－DNJ的含量。方法:采用高效液相色谱法测定，以芴甲氧羰酰氯(FMOC－Cl)为柱前衍生化试剂，对衍生化条件进行了优化;色谱柱为Kromasil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈－0.1%醋酸(50∶50)，流速1.0mL/min，柱温30℃，荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm。结果:1－DNJ在10～35mg/L范围内线性良好(r=0.99959)，检测限为0.80mg/L(S/N =3)，平均回收率为95.38%，相对标准偏差2.28%(n=5)。桑叶中1－DNJ的含量在不同生长季节间存在显著差异。结论:方法简便、快速、准确，适用于桑叶中1－DNJ含量的定量分析。

桑叶，1－脱氧野尻霉素，高效液相色谱法，荧光衍生化

桑叶，是桑科植物桑(Morus albaL.)的叶子，异名“铁扇子”，始载于《神农本草经》，性寒、味甘苦，归肺、肝经，具有祛风清热、凉血明目等功效［1］。1993年我国卫生部公布桑叶为药食两用品，而在《中华人民共和国药典》2010版中也收录桑叶主治风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花［2］。现代药理学的研究表明，桑叶中含有的独特的生物碱1－脱氧野尻霉素(1－DNJ，结构见图1)，是其主要的活性成分之一，具有显著的药理作用。有研究认为，1－DNJ为α－糖苷酶抑制剂，能有效地降低餐后的血糖浓度，达到预防和治疗糖尿病的效果［3－8］。我国是世界上最大的桑树种植国，桑树资源丰富，种类繁多，分布广泛，而1－DNJ在桑叶中的含量也随产地及品种的不同有所差异。有关不同产地不同品种桑叶中1－脱氧野尻霉素含量的分析已有报道［9－10］，而有关不同季节桑叶中1－DNJ含量的比较研究报道较少。本文参照国内外有关文献方法［11－12］，并加以优化，采用柱前衍生化高效液相色谱法建立了桑叶中1－DNJ含量的测定方法，并对北京市大兴区安定镇御林古桑园所产的不同生长季节桑叶中的1－DNJ的含量进行了测定，为今后该地区桑叶的综合开发利用提供了指导。

图1 1－脱氧野尻霉素的结构

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑叶 采自北京市大兴区安定镇御林古桑园(经中国食品药品检定研究院张继副研究员鉴定为桑科植物桑(Morus albaL.)的叶);1－脱氧野尻霉素标准品(纯度≥99%) 上海同田生物技术有限公司;芴甲氧羰酰氯(FMOC－Cl) 美国ALDRICH公司;色谱乙腈、甘氨酸、四硼酸钾 国药集团;冰醋酸 北京化工厂;实验用水 为娃哈哈纯净水;其他试剂 均为分析纯。

Waters2695高效液相色谱系统 配有Waters2475荧光检测器和Empower操作系统，美国Waters公司;SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;SB－4200 DTN超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;超级恒温水槽 上海跃进医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 桑叶样品的制备 准确称取不同季节的干燥桑叶粉末1.0g，加入0.05mol/L的盐酸溶液25mL，80℃下回流 30min，抽滤，取滤液，滤渣再加入0.05mol/L的盐酸溶液25mL重复提取一次，合并两次提取液，浓缩，置于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容，备用。

衍生化过程:取上述提取液20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液(pH=8.5) 20μL及2mmol/L的FMOC－Cl的乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入 1.5mL 0.1%(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后取10μL进行色谱分析。

1.2.2 标准溶液的制备

1.2.2.1 标准储备溶液 精密称取一定量的1－DNJ标准品于10mL容量瓶中，用纯净水定容，得到浓度为1.0g/L的1－DNJ标准品储备液，于4℃避光保存。

1.2.2.2 标准系列溶液 将标准储备溶液用纯净水稀释至浓度为10、15、20、25、30、35mg/L的标准品系列溶液，分别按上述方法衍生化后取10μL进行色谱分析。

1.2.3 空白溶液的制备 准确量取纯净水20μL置于1.5mL的离心管中，加入0.4mol/L的硼酸盐缓冲液(pH=8.5)20μL，及2mmol/L的FMOC－Cl乙腈溶液40μL，振荡混匀，于25℃水浴中反应20min，加入1mol/L的甘氨酸20μL，静置5min，让多余的衍生化试剂反应完。最后加入1.5mL 0.1%(V/V)的醋酸水溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过后取10μL进行色谱分析。

1.2.4 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18分析柱(4.6mm×250mm，5μm)及SunFire C18预柱(4.6mm× 20mm，5μm);流动相:乙腈－0.1%冰醋酸(50∶50，V/V);流速:1.0mL/min;柱温:30℃;荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm;进样体积:10μL。

2 结果与讨论

1－DNJ为典型的哌啶型生物碱，结构中没有苯环、双键及羰基等发色团，不适用于紫外检测，且结构中含有多个羟基，属氮杂糖类，分子极性较大，普通C18色谱柱难以保留，定性定量分析均较困难。FMOC－Cl是一种常见的衍生化试剂，可用于仲胺和伯胺的衍生化，结构中具有荧光发光基团，衍生化产物具有稳定的荧光强度。本实验以FMOC－Cl作为衍生化试剂，将FMOC－Cl在温和的条件下与1－DNJ中的仲胺基团反应生成稳定的荧光衍生物，采用荧光检测器进行检测。解决了1－DNJ无紫外吸收难以检测的困难，同时克服了1－DNJ极性过大，普通C18色谱柱无法保留的缺点。衍生化反应方程式如图2所示。

图2 1－DNJ的衍生化反应方程式

2.1 系统适用性实验

2.1.1 检测波长的选择 参照文献［10－11］的方法，选用激发波长254nm，发射波长322nm进行检测。

2.1.2 流动相比例的选择 流动相(乙腈－0.1%醋酸)中，0.1%醋酸比例大于60%时，1－DNJ的保留时间在10min左右，但色谱峰未能达到良好的分离，且水相比例过高后，色谱柱柱压过高，影响色谱柱的使用寿命。采用体积比65∶35的乙腈－0.1%醋酸作为流动相时，保留时间过长。而选择体积比50∶50的乙腈－0.1%醋酸则能达到较好的分离效果且峰形良好，因此流动相组成为乙腈－0.1%醋酸(50∶50)。

分别取空白溶液、标准品溶液及样品溶液各10μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，结果如图3所示。其中标准品溶液及样品溶液中色谱峰1的峰面积随1－DNJ浓度的变化而呈线性的变化，而空白溶液中无色谱峰1出现，且在同时不加1－DNJ和Gly的空白溶液中只有色谱峰3出现。因此推断，色谱峰1为1－DNJ－FMOC，色谱峰2为Gly－FMOC，色谱峰3为FMOC－OH。从图3中可以看出，样品中的1－DNJ与相邻组分均得到了较好的分离，Gly－FMOC及衍生化试剂的水解产物FMOC－OH均不干扰组分的测定。

2.2 衍生化反应条件的选择

2.2.1 衍生化反应试剂浓度的考察 以标准品系列溶液为对象考察了衍生化试剂FMOC－Cl的浓度对衍生化反应的影响，在 FMOC－Cl的浓度为0～2mmol/L的范围内，衍生化产物随衍生化试剂浓度的增大而增加，在衍生化试剂浓度为2mmol/L时，衍生化产物峰面积达到最大。当衍生化试剂浓度超过3mmol/L时，Gly－FMOC及FMOC－OH的响应信号均超过了检测器检出限，因此最终选择2mmol/L作为衍生化试剂的最佳浓度。

图3 样品高效液相色谱图

2.2.2 衍生化反应时间及反应温度的考察 固定其他条件，将同一浓度的标准品溶液衍生化反应不同时间，衍生化时间分别为5、10、15、20、25min，结果表明:在衍生化反应20min后，衍生化产物的峰面积趋于稳定，因此本实验选择的衍生化反应时间为20min。固定其他条件，将同一浓度的标准品溶液在不同温度下衍生化反应20min，温度分别为20、25、30、35℃，结果表明:在25℃下，衍生化产物达到最大峰面积的时间最短，当衍生化反应温度超过30℃时，衍生化产物的最大峰面积反而降低。因此，本实验选择的衍生化温度为25℃。

2.3 标准曲线与检出限

分别取标准品系列溶液，按上述方法衍生化，取10μL按“1.2.4”色谱条件测定。以标准溶液浓度X对色谱峰面积Y进行线性回归，得回归方程:Y= 1742310X+530220.71，r=0.99959。结果表明，1－DNJ在质量浓度为10～35mg/L的范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，测得信噪比(S/N)为3时，1－DNJ的最低检测限为0.80mg/L。

2.4 精密度实验

精密吸取同一批样品衍生化溶液，按“1.2.4”色谱条件连续进样6次，测得峰面积的RSD为0.58% (n=6)，结果表明，本实验方法精密度良好。

2.5 重复性实验

取同一批桑叶样品，按“1.2.1”的方法平行制备6份，按“1.2.4”色谱条件分别进样，测得峰面积的RSD为0.54%(n=6)。结果表明，本实验方法重复性良好。

2.6 稳定性实验

取同一批桑叶样品，按“1.2.1”的方法制备，置于冰箱中4℃避光保存，分别间隔12h按“1.2.4”色谱条件重复测定6次。结果表明，样品衍生化后在72h保持稳定，RSD为0.46%(n=6)。

2.7 加样回收率实验

准确称取已知1－DNJ含量的桑叶样品适量，平行称取5份，分别精密加入一定量的1－DNJ标准品，按“1.2.1”的方法制备，并按“1.2.4”色谱条件测定1－DNJ含量，结果见表1。平均回收率为95.38%，RSD为2.28%。

表1 1－DNJ加样回收率的测定(n=5)

2.8 不同季节桑叶中1－DNJ含量的测定

准确称取不同季节采集的桑叶样品，按“1.2.1”的方法制备，并按“1.2.4”色谱条件测定1－DNJ含量。结果见图4。

图4 不同季节桑叶中1－DNJ的含量变化

3 结论

本实验对产自北京市大兴区安定镇御林古桑园的不同季节的桑叶中1－DNJ的含量进行比较，结果表明在相同的提取和检测条件下，7、8、9月份桑叶中1－DNJ的含量明显高于10月和11月，其中8月份含量最高，说明桑叶中1－DNJ的含量可能与气侯温度等因素有关，夏季(7、8、9月份)温度较高，雨水光线充足，桑叶较成熟，桑叶中1－DNJ的含量较高，秋季(10、11月份)温度较低，桑叶中1－DNJ的含量也随之减少。结果初步揭示了北京地区所产桑叶中1－DNJ的含量随季节变化的趋势，对推动该地区桑资源的开发利用，具有一定的指导意义。

高效液相色谱－荧光检测法检测桑叶中1－脱氧野尻霉素(1－DNJ)的含量，具有准确性高、选择性强、重现性好等特点，可用于桑叶中1－脱氧野尻霉素(1－DNJ)含量的测定。

［1］王丰俊，王建中，郝俊，等.响应面法优化超声波辅助提取桑叶多糖的工艺研究［J］.北京林业大学学报，2007，29(5): 142－146.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010:279－280.

［3］顾关云.桑的化学成分和生物活性研究进展［J］.国外医药·植物药分册，2007，22(1):12－17.

［4］Asano N，Tomioka E，Kizu H，et al.N－containing sugars from Morus alba and their glycosidase inhibitory activities［J］. Carbohydr Res，1994，259(2):243－255.

［5］Naowaboot J，Pannangpetch P，Kukongviriyapan V，et al，Antihyperglycemic，antioxidantand antiglycation activitiesof mulberry leaf extract in streptozotocin－induced chronic diabetic rats［J］.Plant Foods Hum Nutr，2009，64(2):116－121.

［6］Mudra M，Ercan－Fang N，Zhong L，et al，Influence of mulberry leaf extract on the blood glucose and breath hydrogen response to ingestion of 75g sucrose by type 2 diabetic and control subjects［J］.Diabetes Care，2007，30(5):1272－1274.

［7］Wang LL，Zhou ZY.Effect of extracts of mulberry leaves processed differently on the activity of alpha－glucosidase［J］.Int J Food Agr Environ，2008，6(3－4):86－89.

［8］Hansawasdi C，Kawabata J.Alpha－glucosidase inhibitory effect of mulberry(Morus alba)leaves on Caco－2［J］.Fitoterapia，2006，77(7－8):568－573.

［9］陈松，刘宏程，储一宁，等.12个桑树品种桑叶中的1－脱氧野尻霉素含量测定与分析［J］.2007，33(4):637－641.

［10］孟夏，欧阳臻，常钰，等.不同产地桑叶的1－脱氧野尻霉素含量比较［J］.2008，31(1):8－10.

［11］欧阳臻，李永辉，徐卫东，等.高效液相色谱－荧光检测法测定桑叶中1－脱氧野尻霉素(DNJ)含量［J］.中国中药杂志，2005，30(9):682－685.

［12］Kim J W，Kim S U，Lee H S，et al.Determination of 1－deoxynojirimycin in Morus alba L.leaves by derivatization with 9－flurenylmethyl chloroformate followed by reversed－phase highperformance liquid chromatography［J］.J Chromatogr A，2003，1002(1－2):93－99.

Determination of 1－deoxynojirimycin in Morus alba L.leaves of different seasons by fluorometric derivatization

LI Ji－wen1，2，GUO Xiao－yan2，WANG Teng2，LI Cui－Qing2，*
(1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China; 2.Beijing Institute of Petrochemical Technology，Beijing 102617，China)

Objective:To develop a high performance liquid chromatographic method for the determination of 1－deoxynojirimycin(DNJ)in Morus alba L.leaves and contrast the content of 1－DNJ in different seasons.Methods: The separation was performed with a Kromasil C18column(4.6mm×250mm，5μm)at 30℃ and the mobile phase consisted of acetonitrile－0.1%aqueous acetic acid(50∶50)，at the rate of 1.0mL/min.The 1－DNJ marked with 9－fluorenylmethyl chloroformate(FMOC－Cl)was detected at excitation wavelength of 254nm and emission wavelength of 322nm.Results:The calibration curve was linear over the concentration range from 10mg/L to 35mg/L (r=0.99959)，the limit of detection was 0.80mg/L(S/N=3)and the average recovery was 95.38%(RSD=2.28%). The results showed that the content of 1－DNJ was significantly different in different seasons.Conclusion:This method was simple，rapid，and accurate and was suitable for the determination of 1－DNJ in Morus alba L.leaves.

Morus alba L.leaves;1－ deoxynojirimycin;high performance liquid chromatography; fluorometric derivatization

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0462－04

2011－08－29 *通讯联系人

李继文(1983－)，男，硕士研究生，研究方向:天然产物化学。

教育部科学技术研究重点项目(211003);北京市教育委员会科技发展计划面上项目(KM201110017002)。