咪唑类离子液体系列对卤虫的急性毒性研究

卢珩俊,陆 胤,徐冬梅,魏 超,陈梅兰*(.浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江 杭州 3005；.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西 桂林 54004)

咪唑类离子液体系列对卤虫的急性毒性研究

卢珩俊1,2,陆 胤1,徐冬梅1,魏 超2,陈梅兰1*(1.浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江 杭州 310015；2.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西 桂林 541004)

选取卤虫作为实验生物,研究了1-丁基,1-辛基,1-十二烷基-3甲基咪唑盐酸盐( [Cnmim][Cl](n = 4,8,12) ) 3种离子液体的暴露对卤虫个体存活率的影响.同时,选取了实验室常用的有机试剂甲醇和乙腈,无机化学品重铬酸钾作为阳性对照.根据剂量效应曲线的拟合结果发现,受试离子液体系列随着咪唑环上烃基侧链碳原子数的增加,对卤虫的毒性效应也相应增强,3种离子液体对卤虫的 LC50-24h依次为171.1,133.6,17.76μg/mL.离子液体对卤虫的LC50-24h比甲醇(LC50-24h=84.83mg/mL)和乙腈(LC50-24h=52.84mg/mL)低了2～3个数量级,重铬酸钾对卤虫的(LC50-24h=16.87μg/mL)与离子液体对卤虫的LC50-24h处于同一水平.

室温离子液体；水生生物；卤虫；急性毒性；剂量-效应关系

许多化学反应和分离过程需要涉及大量的易挥发有机溶剂而造成环境污染.近年来,一种新型溶剂——离子液体引起了学界的广泛兴趣.离子液体的定义为"完全由离子组成的在低温下(一般低于 150℃)呈液态的盐′[1],也称为室温离子液体或低温熔融盐.它一般由较大的有机阳离子和较小的无机阴离子组成.离子液体几乎不挥发、不易燃、导电性强、性质稳定、对许多无机盐和有机物有良好的溶解性,因此在分离过程和化学反应等领域显示出良好的应用前景[2-3].

目前关于离子液体对生物的毒性效应的研究还相对较少.一些研究者以乙酰胆碱酯酶[4-5]、哺乳动物细胞系[6-7]、微生物[8-10]、土壤线虫[11]、高等植物[12-13]和大型蚤[14-15]等为研究材料在不同测试水平上对生物的毒性效应进行了初步探讨.从已有的报道来看,研究的主要方向集中在离子液体的不同组成部分对离子液体毒性的影响上.研究方法则以生物个体水平的毒性试验研究为主,少量涉及分子、细胞水平的毒性试验以及建立离子液体的构效关系(SAR)等方面[6,12].

但目前的受试生物大都属于淡水生态系统,涉及离子液体对海洋生态系统生物的毒性方面只有Latala[16]曾报道离子液体对2种海藻的毒性作用.而淡水生态系统只占地表水生生态系统的一小部分,若要表征离子液体对海洋生态系统的影响,则需要以生活在海水(盐水)中的模式生物进行研究.本实验选用卤虫作为受试生物.卤虫是一种广盐性浮游生物,处于海洋(盐水)生态系统食物链的底端,分布范围广[17],具有广泛的环境代表性,且卤虫对许多药物和有毒物质的敏感性较高,虫卵易获得、实验结果易观察、实验运行费用低等诸多优点,已被广泛应用于评价药物和有毒物质对水环境的影响[18].但用卤虫作为模式生物对离子液体的毒性进行研究尚未见诸报道.本实验以有机试剂甲醇和乙腈及无机药品重铬酸钾作为阳性对照物,考察卤虫模型的稳定性和实验数据的可靠性;然后用 1-丁基,1-辛基,1-十二烷基-3甲基咪唑盐酸盐3种离子液体使用相同的染毒方法和死亡个体计数标准对卤虫进行毒性试验;最后对它们的剂量-效应关系进行拟合,根据拟合曲线计算出 LC50-24h,为更深入地研究他们对卤虫的生物毒性提供参考数据.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

N-甲基咪唑 (99%,浙江临海凯乐化工厂),重铬酸钾、氯代正丁烷 (化学纯,中国国药集团上海化学试剂有限公司)、氯代正辛烷(化学纯,上海邦成化工有限公司),氯代正十二烷 (95%,日本国东京化成工业株式会社),Sera 海盐(D52518 Heinsberg),碳酸氢钠(分析纯,上海虹光化工厂有限公司),甲醇(分析纯,上海申翔化学试剂有限公司),乙腈(分析纯,成都市科龙化工试剂厂).

加热磁力搅拌器(RCT基本型,德国 IKA集团混合分散生产设备公司),接触式电子温度计(EST-D5,德国 IKA集团量热分析技术公司).DAUF管(1.5mL,购自杭州市华东医药股份有限公司),芬兰单道移液器(Finnpipette) (量程0.5～10μL 和量程 1～5mL,热电(上海)仪器有限公司 Thermo Electron Corporation),恒温水浴锅(HH-6型,常州国华电器有限公司),超纯水机(Millipore,Molsheim,France).

30‰和 60‰的人工海水:分别称取 30g和60g Sera海盐用超纯水稀释到 1000mL,再用NaHCO3调节 pH 值至 8.5±0.1,以保持人工海水内氧气和二氧化碳的正确比例.然后在室温下放置备用,每隔2周放入充气泵头,曝气24h,该人工海水可保持40～60d不变质.

1.2 实验方法

1.2.1 离子液体合成及其纯度评价 按照Shimojo等的方法[19]用等物质量的N-甲基咪唑和氯代正丁烷、氯代正辛烷、氯代正十二烷在适当水浴温度下合成 1-丁基-3-甲基咪唑盐酸盐、1-辛基-3-甲基咪唑盐酸盐和1-十二烷基-3-甲基咪唑盐酸盐 3种离子液体. 离子液体的结构如图 1.参考Cassol等[20]的方法利用核磁共振仪测定所合成离子液体的13C-NMR谱和1H-NMR谱,解谱得到合成离子液体的主成分纯度数据,结果见表1 .

图1 用于本研究的咪唑类离子液体的结构Fig.1 Structures of the imidazolium ionic liquids used in this study

表1 3种离子液体产品的纯度Table 1 Purity of three studied ionic liquids products

100.0 μg/mL的离子液体贮备液配制:分别称取以上合成的[C4mim]Cl、[C8mim]Cl和[C12mim]Cl三种离子液体各1.000g于100mL容量瓶中,用超纯水定容,备用.

1.2.2 卤虫卵的预选和卤虫的孵化[21]购回的卤虫卵(银湖牌,购自浙江省杭州市吴山花鸟市场)用饱和盐水洗去沙粒等杂质(沙粒、泥沙等杂质沉于饱和盐水底部,卤虫卵浮于液面),淡水洗去空壳(空卵浮于淡水液面,优质卵则沉于淡水底部),20℃烘干后,于冰箱内4℃以下保存备用.

取适量于低倍显微镜下观察、预选,进一步除去空卵,然后平摊于大培养皿中,在通风干燥向阳处自然光下曝光2昼夜(2×24h).曝光后,取适量虫卵于DAUF管底部(一般以铺满DAUF管底部为宜);用移液器加入配制好的 30‰人工海水;适当弹击小管,去除贴壁张力;将装好卤虫卵的DAUF管放入恒温水浴锅,水温保持在(28±2)℃,实验过程中保持水温和水质的稳定,光源从侧面照射(光照强度约1000 lux).24h后,该卵即孵化为实验所需的 II～III期卤虫无节幼虫.孵化时间控在24h内,若超过48h,因卤虫活力下降,弃去不用.

1.2.3 卤虫的染毒 卤虫经 1.2.2孵化后,将孵化培养皿从水浴锅中取出,吸除上浮而未孵化的虫卵,优选出不易下沉、活力较强、体色较红、运动正常(附肢划水,虫体向前泳动,有时上下翻滚,泳动频率一般4次/s)的优质卤虫,并用吸管吸到盛有30‰人工海水的小培养皿中,备用.

取1.5mL DAUF管,加入500μL离子液体溶液(纯水配制)和 500μL 60‰的人工海水,实验的实际盐浓度为 30‰,对照空白组直接取 1000μL 30‰的人工海水.然后用1μL移液器逐个加入优选得到的10个同步生长的优质卤虫,进行染毒培养. 染毒24h后(即孵化后48h),在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目,若卤虫5s内无显著运动迹象,或摇晃过程中直接随水流下沉者则判为死亡个体.实验过程要求空白对照组的校正死亡率应控制在5%以内(若超过5%,则本组试验数据无效,需要查找原因,重新进行实验).

1.2.4 卤虫模型的敏感性测试 以不同浓度的甲醇、乙腈、重铬酸钾按1.2.3的方法分别检测对卤虫的毒性效应.结果见表 2,表 2中校正死亡率及LC50-24h值为5 次有效重复实验数据的平均值.它们对卤虫的剂量-效应曲线(DRC)如图2.

表2 卤虫对已知毒物的染毒情况Table 2 The sensitivity of brine shrimp towards the known positive control agents

测试结果显示,重铬酸钾对卤虫表现出强烈的毒性.而甲醇、乙腈的毒性相对较低,可能原因是前两种毒物都是挥发性有机物,而卤虫实验全过程处于开放体系中,在实验过程中这两种可能发生挥发作用,使得卤虫实际的毒物接受剂量小于理论值,或者卤虫对于上述两种有机物的代谢机制与其他生物有所不同;而重铬酸钾具有强氧化性,会损伤细胞内的染色体,当浓度为0.04mg/mL时,校正死亡率已达到100%.测试结果表明,卤虫对化学毒性物质具有较高的敏感性,作为离子液体毒性试验的模式生物是合适的.

1.2.5 离子液体急性毒性的预试验 通过预实验旨在找出卤虫全部存活、部分死亡和全部死亡的浓度区间,为正式实验作准备.

取离子液体贮备液(100mg/L)进行稀释得到一系列浓度,进行预实验,直至得到卤虫全部存活、部分死亡和全部死亡的正式实验浓度区间.预实验的每个浓度梯度设置5个平行样本,每一毒物设置一个空白组,每个浓度样点重复试验10次.

预实验结果:各离子液体全部存活和全部死亡区间,[C4mim]Cl约在 100～500 μg/mL;[C8mim]Cl约在 10～300μg/mL; [C12mim]Cl 约在 1～100 μg/mL.

1.2.6 离子液体急性毒性试验 根据预实验的结果,在[C4mim]Cl、[C8mim]Cl 和[C12mim]Cl 3种离子液体的实验组中以合适的公差分别设置12、15和13个浓度样点,设置的浓度样点以有效覆盖剂量-效应曲线(DRC)中部为最终目标,同时向高低浓度 2个方向作适当延伸,以上离子液体水溶液的实际浓度用文献方法[22]验证,分别按1.2.4方法进行染毒试验.正式实验每个实验浓度设置5个平行组,每种毒物组设置一个空白,每个浓度样点重复试验15次以上.卤虫致死校正死亡率按以下公式计算:

图2 阳性对照对卤虫的剂量-效应曲线(DRC)Fig.2 Dose-response curves of the positive control toxicity to brine shrimp

1.2.7 剂量-效应曲线(DRC)的拟合方法 对实验测得的 DRC散点图进行数学拟合的传统方法是线性回归法,它只适应于DRC中线性部分的描述,其他部分特别是低剂量区域信息无法评价,因而不能有效表达整个 DRC信息[23].本研究先用迪克逊(Dixon)法对数据进行离群值检验,剔除其中的可疑值,对剩余的有效数据取算术平均值,得到每一浓度点的校正死亡率平均值.再将以上校正死亡率平均值与对应浓度的对数值输入计算机,应用 Origin 8.0软件,以毒物浓度的对数值为横坐标,以对应浓度的平均校正死亡率为纵坐标作出散点图.根据实验得到的DRC数据散点图的大致形状,同时根据DRC数据实验点的个数,利用Origin 8.0软件中非线性最小二乘拟合(NLSF)模块下的拟合工具,同时使用DseResp、Weibull与Logit 3种非线性函数模型[24-25]对实验 DRC数据进行非线性拟合,进而求得各个拟合模型的相关参数.然后对模拟效果进行比较分析,选择拟合相关系数最大而拟合均方根误差最小者为最优拟合模型,结果显示最优拟合函数模型为DseResp函数.最后,用该函数对所有散点图进行非线性拟合,计算出该离子液体对于卤虫的毒理学参数 LC50-24h值(染毒 24h后卤虫校正死亡率为50%时的样品浓度)95%置信区间所得拟合曲线即为被试验的离子液体对卤虫的毒性-效应曲线.经对比,与实验结果符合得最好的剂量-效应曲线(DRC)所对应的最优拟合模型函数及其反函数表达式如表3.受试3种离子液体对卤虫的剂量-效应曲线(DRC)如图3.

表3 剂量-效应曲线(DRC)的非线性拟合函数Table 3 Selected non-linear fitting functions describing dose-response curves (DRC)

图3 [Cnmim][Cl](n = 4,8,12)对卤虫的剂量-效应曲线(DRC)Fig.3 Dose-response curves of the toxic effects of [Cnmim]Cl(n=4,8,12) to brine shrimp

2 结果与讨论

2.1 离子液体对卤虫的剂量-效应曲线(DRC)

利用 DseResp函数进行非线性拟合,得到 3种离子液体的拟合参数和模型方程(函数表达式见表3).将所得参数代入其反函数,可得各个效应浓度(表 4).由表 4 可知用 DseResp函数拟合DRC时,对低效应区和高效应区浓度均可有效估计,由模型计算的 3种离子液体的效应拟合值与实验值均为 R＞0.9,拟合统计性显著性水平较高.可见卤虫作为离子液体毒理试验的模式生物是合适的.

表4 3种物质对卤虫的毒性效应Table 4 Collective parameters for Toxicities of the 3 studied ionic liquids to brine shrimp

根据 3种离子液体对卤虫毒性效应拟合曲 线的趋势(图 3,3-a～3-d)可得,不同的离子液体所对应曲线的形状和斜率有所不同,相应的LC50-24h值也不同,跨度约为1个数量级左右.它们对卤虫的抑制毒性效应曲线都是非线性变化趋势,呈现典型的 S型剂量-效应关系.若以 LC50-24作为毒性强弱判断标准,离子液体对卤虫的抑制毒性顺序为; [C12mim]Cl＞[C8mim]Cl＞[C4mim]Cl.与对照试剂甲醇、乙腈和重铬酸钾相比,离子液体对卤虫的LC50-24h值与甲醇和乙腈对卤虫的LC50-24h值分别相差2～3个数量级,远远低于前两者,略高于重钾酸钾,可见这类离子液体对卤虫的毒性较大.

2.2 离子液体结构与其毒性效应的关系

实验表明,随着离子液体碳链加长,平均校正死亡率接近 100%时所对应的浓度不断降低,从[C4mim]Cl的约 500μg/mL 到[C12mim]Cl的约25μg/mL.

通常认为毒物对生物的急性毒性作用与毒物分子和靶细胞内敏感区——靶分子的特异结合作用有关[26],生物与毒物接触,可影响或干扰其正常新陈代谢,从而使生物的存活数目增大或减少,因此能够显示受试物质对生物体的毒性作用,这种影响除与毒物剂量有关外,还与其自身的结构或性质有关.

实验数据显示,咪唑环的侧链长度与离子液体对卤虫的 LC50-24h值的相关性较大,碳链越长毒性越大,环上碳原子数越多毒性越大.被试验的离子液体系列相对毒性随侧链碳链的增长显著增加.其中,[C4mim]Cl到[C8mim]Cl咪唑环侧链碳原子数增加 4,[C8mim]Cl的 LC50-24h值降为[C4mim]Cl的 78.08%;[C4mim]Cl到[C12mim]Cl咪唑环侧链碳原子数增加 8, [C12mim]Cl的LC50-24h值降为[C4mim]Cl的10.38%;可见随着碳链长度的增加,相应离子液体 LC50-24h值的下降速度较为显著.

在现有实验数据的基础上,结合其他研究者的结论[6,27-29],我们推测原因可能是离子液体的分子结构与阳离子表面活性剂的结构相似[28],它们可与细胞膜上的蛋白质作用,从而破坏细胞膜结构,或增大细胞膜的渗透性;且随着离子液体阳离子取代烷基侧链的增长,离子液体亲脂性增强,故对细胞膜的破坏作用也相应增大.我们也推测,由于离子液体阳离子侧链具有一定的亲脂性,可能会经由细胞膜的磷脂双分子层直接进入卤虫全身细胞内,从而干扰其正常的生理活动,当卤虫体细胞内的离子液体阳离子浓度达到一定量时则会直接导致卤虫死亡.

此外,随着3种离子液体侧链长度的增加,各离子液体剂量-效应拟合曲线中点(平均校正死亡率=50%处)的斜率逐渐增大,图形上表现为毒性作用曲线的中部逐渐变陡,这可能提示:在剂量-效应拟合曲线中点附近,咪唑环侧链较长的离子液体浓度的细微改变所引起的校正死亡率的变化幅度要大于咪唑环侧链较短者.其次,随着咪唑环侧链的增长,各离子液体剂量-效应拟合曲线下渐近线的位置逐渐抬高(见图3-d),上、下渐近线之间的差值(Span)有逐步缩小的趋势,表明咪唑环侧链的增长过程中,这类离子液体的中毒阈值会不断降低.

3 结论

3.1 3种离子液体[C4mim]Cl、[C8mim]Cl、[C12mim]Cl对卤虫的抑制毒性呈现典型的 S型剂量-效应关系, 若以 LC50-24h作为受试物质对卤虫毒性强弱的依据,它们对卤虫的抑制毒性顺序为: [C12mim]Cl＞[C8mim]Cl＞[C4mim]Cl.

3.2 咪唑类离子液体阳离子的分子结构与其对卤虫的毒性有密切关系,咪唑环上所连碳链长度与其对卤虫毒性的关系密切,所连碳链越长毒性越大,且在链碳的增长过程中,其毒性的增强效果明显.

3.3 在所选的3种拟合函数中,对于实验结果的最优拟合函数模型为 DseResp函数,结果显示该函数对低效应区和高效应区浓度均可进行有效估计,适用于卤虫实验数据的处理.

3.4 鉴于离子液体潜在的物种数目极大[30],而卤虫的存活周期短、成本低廉,可成为未来对高毒离子液体毒性进行大范围的初筛试验中理想的模式生物.

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Research on the acute toxicity of imidazolium ionic liquids on the brine shrimp.

LU Heng-jun1,2, LU Yin1, XU Dong-mei1, WEI Chao2, CHEN Mei-lan1*(1.College of Biology and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China；2.College of Chemistry and Biological Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：454～460

In this paper, the effects of three imidazolium ionic liquids, 1-butyl-, 1-octyl- and 1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride on the inhibiting concentration to the growth of brine shrimp in artificial sea water were carefully studied. At the same time, toxic organics such as methanol and acetonitrile and toxic inorganics like potassium dichromate were selected as positive control for the investigation of the effect of ILs on the brine shrimp. Dose-response curve fittings were established for the ionic liquids and the positive control toxins. The experimental results showed that with increasing the alkyl chain length of the ionic liquids, their toxicity to brine shrimp accordingly increased (LC50-24hvalues were 171.1, 133.6, 17.76μg/mL for the three ionic liquids, respectively). The LC50-24hvalues of the three imidazolium ionic liquids were found to be 10-2to 10-3of the values of methanol and acetonitrile while being much close to that of potassium dichromate.

room-temperature ionic liquids (ILs)；hydrobios；brine shrimp；acute toxicity；dose-response relationship

X503.2

A

1000-6923(2011)03-0454-07

2010-07-08

国家自然科学基金资助项目(20775070);浙江省自然科学基金资助项目(Y5100280)

* 责任作者, 教授, rain-lake@163.com

卢珩俊(1986-),男,浙江金华人,桂林理工大学硕士研究生,主要研究方向为环境毒理学及环境分析化学.