瓶装泥螺和蟹糊可培养细菌的分离与鉴定

黄 键，陈 燕，全晶晶，张春丹，李 晔，裘迪红，汤海青，李和生，苏秀榕,*，章超桦，秦小明

(1.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

瓶装泥螺和蟹糊可培养细菌的分离与鉴定

黄 键1，陈 燕1，全晶晶1，张春丹1，李 晔1，裘迪红1，汤海青1，李和生1，苏秀榕1,*，章超桦2，秦小明2

(1.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

为提高泥螺和蟹糊的贮藏时间，确保生食的食用安全性，本实验利用常规方法从瓶装泥螺中分离和鉴定出3株细菌，分别是弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、绿色气球菌(Aerococcus viridans)和乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)；从瓶装蟹糊中分离和鉴定出的4株细菌分别为：鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和纤细发光杆菌(Photobacterium angustum)。16S rRNA鉴定鉴定结果表明只有纤细发光杆菌的鉴定结果与MIS鉴定的结果不一致。除卡他莫拉菌、绿色气球菌和乳酪短杆菌外，其余菌都随着温度升高，长势增强。7株细菌中除卡他莫拉菌在低温冷藏(4℃)条件下长势明显增加外，其余菌都在低温冷藏(4℃)条件下长势明显减弱。7株菌都具有胶原蛋白酶和酪蛋白酶活性，藤黄微球菌和纤细发光杆菌不能分解利用淀粉，所有的分离菌株都没有酯酶活性。这些菌的生长温度范围为4～35℃(最适温度35℃)，盐度范围为3%～7%(最适盐度3%)，pH值范围5.0～9.0(最适pH7.0)。

泥螺；蟹糊；细菌自动鉴定；16S rRNA；PCR扩增

泥螺又名麦螺、梅螺、黄泥螺，是我国东部沿海重要的经济贝类。其肉质鲜美，具有很高的营养价值，深受人们的喜爱。泥螺经腌制再加酒、糖等佐料配制后，咸甜适宜，味道鲜美，风味独特，一直是江浙沿海一带广大居民的传统风味食品。

蟹糊是一种特色腌制水产品。它是以新鲜三疣梭子蟹为原料，经腌制后斩碎，再加上适量的酒、味精等调制而成。其加工工艺简单，能够充分保持原料的鲜美风味和丰富营养，兼有易消化吸收、耗能少等诸多优点。

近年来，随着市场需求量的上升，蟹糊和泥螺由传统家庭制作的散装产品转向工业化生产的瓶装蟹糊、泥螺而畅销全国各地。然而瓶装蟹糊和瓶装泥螺都属生食水产品，受细菌污染普遍，又由于在加工过程中不能添加抑菌剂、防腐剂，也易受诸因素影响，难以控制细菌数量[1-3]。为了解瓶装泥螺中的细菌类别和组成，寻找一种细菌总数控制技术，本实验对瓶装泥螺和蟹糊产品中的细菌进行分离鉴定，并对其胞外酶活性和生长条件进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与培养基

瓶装泥螺和蟹糊(刚生产的)购于宁波超市。

细菌自动鉴定的皂化试剂、甲基化试剂、萃取溶剂、碱洗涤试剂 美国Sigma公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR扩增试剂、pMD18-T载体 日本TaKaRa公司；DNA快速纯化试剂盒 捷瑞生物工程上海有限公司；其他试剂为分析纯。

TSBA培养基、胰蛋白酶大豆肉汤培养基 美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

无菌条件下开启瓶盖，用无菌镊子从瓶内上、中、下部分夹取样品，剪碎、研磨，采用10倍稀释法分离细菌。每批样品取10瓶，实验重复3次。

1.2.2 细菌的分离纯化及革兰氏染色

采用涂布法，经划线纯化后获得纯种菌落并进行革兰氏染色[4]。

1.2.3 细菌的Sherlock MIS自动鉴定

将细菌划线接种到含2.7% NaCl的TSBA培养基上，28℃培养24h。用接种环从四区划线中的第三区刮取一环，按照MIS Chapter操作手册进行皂化、甲基化、萃取、碱洗涤。利用7850型气相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)进行检测。利用微生物鉴定系统(MIS)识别脂肪酸的种类和数量，并与计算机自带的数据库内已知细菌的脂肪酸图谱进行比较，自动读取鉴定结果[5]。

1.2.4 细菌的分子生物学鉴定

1.2.4.1 DNA模板的制备[6]

挑取单菌落于25μL无菌超纯水中，混匀，沸水浴裂解10min，10000r/min离心2min，取上清液，－20℃储存备用。

1.2.4.2 PCR扩增反应

采用16S rDNA通用引物，正向引物16SF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物16SR：5＇-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3＇。25μL PCR反应体系为：10×buffer 2.5μL、25mmol/L MgCl22.5μL、2.5mmol/L dNTPs 2.0μL、10μmol/L 引物各1.0μL，1.0U Taq酶、模板DNA 0.5μL，无菌超纯水补足至25μL。反应在PCR仪上进行，循环参数为：95℃预变性4min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1.3%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4.3 测序及数据分析

PCR产物经割胶回收后连接至pMD18-T载体上，再转化至E.coli DH5α细胞中测序[7]。并将细菌的16S rDNA序列与NCBI数据库中各种细菌的序列进行比对[8-11]。

1.2.5 胞外酶活性测定

挑取单菌落接种到牛肉膏和蛋白胨液体培养基中，28℃培养24h。培养液于10000r/min离心10min，吸取上清液，用直径为0.22μm的滤膜过滤得到胞外产物。将牛津杯置于淀粉琼脂培养基、胶原蛋白琼脂培养基、酪蛋白琼脂培养基、吐温-80琼脂培养基上，注入250μL胞外产物，35℃培养48h。分别用卢哥氏碘液、酸性氯化汞、10%三氯乙酸及10%三氯化铁染色，观测分解圈的大小[12]。

1.2.6 菌株生长条件测定

分别以温度、盐度(不同质量分数的NaCl溶液)、pH值进行单因素试验。用分光光度计测定菌液的OD400nm值，以表示菌的生长状况[13]。每组设两个平行实验。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

从瓶装泥螺中分离到3株细菌，编号为BE1、BE2、BE3；从瓶装蟹糊中分离到4株细菌，编号为XH1、XH2、XH3、XH4；其中XH3、BE1分别为瓶装蟹糊、泥螺中的优势菌。

2.2 细菌自动鉴定

MIS操作系统规定第一选择的相似指数(SI)在0.500以上，且第一选择和第二选择的SI差值大于0.100，则可以认为鉴定结果为第一选择所列的菌种名。若SI值在0.300到0.500之间，且第一选择和第二选择的SI差值大于0.100，则表明第一选择与第二选择分开，鉴定可能成功，但是第一选择所列的菌种为非典型的菌株。当SI值小于0.300时，则认为该菌株不存在于数据库中，但软件会给出一个最相关的菌株。

表1 Sherlock MIS细菌鉴定结果Table 1 Bacterial identification by using Sherlock MIS

从表1可知，在7株待鉴定细菌中，XH3、XH4、BE1鉴定的第一选择SI值大于0.500，表明鉴定成功。XH1、XH2、BE2、BE3鉴定的第一选择SI值小于0.300，系统对该菌的鉴定结果尚有待验证[14]。

2.3 细菌的16S rDNA序列扩增结果

对采用水煮法获得的纯种细菌基因组DNA进行PCR扩增。图1扩增结果表明，在退火温度56℃条件下，所有细菌均能扩增出特异性目的条带，条带清晰且没有杂带，扩增片断约900～1000bp。

图1 7株细菌的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products for 7 bacterial strains

2.4 DNA序列比对

登陆NCBI网站，使用GeneBank BLSTN分析软件与数据库中各种细菌的16S rDNA序列进行同源性比对，并依此构建系统发育树。序列比对结果显示，菌株与数据库给出的已知菌株同源性均在99%以上。各菌株同源性最高的参考菌株及同源性见表2。在所分析的7株待测细菌中，有6株细菌16S rDNA序列分析的结果与MIS鉴定的结果相符合，一致性为85.71%，且有些结果达到了种的水平，表明鉴定结果的可靠性较高。

表2 16S rDNA序列比对及与MIS鉴定结果的比较Table 2 16S rDNA sequence alignment and comparison with MIS identification results

2.5 革兰氏染色及胞外酶活性

表3 细菌革兰氏染色及胞外酶活性测定结果Table 3 Gram staining and extracellular enzyme activity

由表3可见，瓶装泥螺中分离到的3株细菌全部是革兰氏阳性菌，瓶装蟹糊中分离到两株革兰氏阳性菌，2株革兰氏阴性菌。瓶装蟹糊和泥螺中分离到的所有菌株都具有胶原蛋白酶和酪蛋白酶活性。蟹糊中有两株细菌不能分解利用淀粉。所有的分离菌株都没有酯酶活性。蟹糊和泥螺都是富含蛋白质的食品，这些细菌将会分解其中的蛋白质，对蟹糊和泥螺的货架期产生影响。

2.6 分离细菌的生长条件

2.6.1 温度对菌株生长的影响

图2 温度对菌株生长的影响Fig.2 Effect of temperature on bacterial growth

菌种在液体培养基中活化后，以相同的初始菌浓度，接种0.1mL于5mL的液体培养基中，分别置于4、25、35℃条件下培养12h。从图2可知，多数细菌(包括两株优势菌XH3和BE1)在35℃时长势最好，表明随着温度升高，细菌生长速度加快。许多细菌在10℃以下难以生长，嗜冷菌增殖缓慢，非嗜冷菌不耐低温，生长受到限制。7株细菌中有6株菌在低温冷藏(4℃)条件下长势明显减弱，表明低温贮藏能在一定程度上抑制这些细菌的生长，适当延长货架期[15]。

2.6.2 盐度对菌株生长的影响

图3 盐度对菌株生长的影响Fig.3 Effect of salinity on bacterial growth

细菌在液体培养基中活化后，以相同的初始菌浓度，接种0.1mL于5mL NaCl质量分数分别为3.0%、5.0%、7.0%的液体培养基中，置25℃条件下培养12h。从图3可知，在NaCl质量分数3.0%～7.0%范围内，不同细菌对盐度的适应性差别较大。优势菌XH3和BE1都是广耐盐细菌，在实验组的各个不同盐度条件下都生长良好。

2.6.3 pH值对菌株生长的影响

图4 pH值对菌株生长的影响Fig.4 Effect of pH on bacterial growth

将细菌以相同的初始菌浓度，接种0.1mL于5mL pH值分别为5.0、7.0、9.0的液体培养基中，25℃培养12h。从图4可知，7株细菌都是在中性条件下长势最好，过酸、过碱生长速度都会减弱。

3 结论与讨论

本实验利用Sherlock MIS细菌鉴定技术鉴定出瓶装泥螺中的3株细菌为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)、绿色气球菌(Aerococcus viridans)和乳酪短杆菌(Brevibacterium casei)。王国良等[16]分离和鉴定了养殖泥螺体内的细菌绝大多数是革兰氏阴性杆菌，占总菌株的88.15%。优势菌属为肠杆菌科(Enterobacteriaceae) 61株、气单胞菌属(Aeromonas)58株、弧菌属(Vibrio) 27株、假单胞菌属(Pseudomonas)21株，其次有不动杆菌属(Acinetobacter)11 株、莫拉氏菌属(Moraxella)9 株、葡萄球菌属(Staphylococcus)8株、芽孢杆菌属(Bacillus) 8株、棒状杆菌属(Corynebacterium)7株、微球菌属(Micrococcus)2株，另有5株细菌在传代中失去生长能力。肠杆菌科细菌主要出现在7月和9月，5月弧菌属细菌检出率较高。所以，泥螺的加工与环境中的细菌种类有关。

瓶装蟹糊中鉴定出的细菌为鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和纤细发光杆菌(Photobacterium angustum)。2008年，杨宪时等[17]鉴定了蟹糊中的细菌初期主要是棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、玫瑰色库克菌(Kocuria rose)、葡萄球菌(Staphy lococcus)和马红球菌(Rhodococcus equi)。球菌是蟹糊加工中普遍存在的，这些菌多数为广耐盐细菌，低温可抑制其生长，在中性pH值条件下长势最好。所以，有效控制细菌增殖速度，对保证产品品质和延长货架期是至关重要的。蟹糊和泥螺产品在生产过程中存在的细菌污染问题主要源自两个方面：一是原料控制不严格，二是加工过程温度控制不够严格。整个加工过程的物料温度应控制在0～5℃，低温贮藏是目前应用最广泛、最有效的抑菌方法。

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Isolation and Identification of Cultivable Microorganisms in Bottled Crab Paste and Salted Mudsnail

HUANG Jian1，CHEN Yan1，QUAN Jing-jing1，ZHANG Chun-dan1，LI Ye1，QIU Di-hong1，TANG Hai-qing1，LI He-sheng1，SU Xiu-rong1,*，ZHANG Chao-hua2，QIN Xiao-ming2
(1. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In order to increase the storage time and ensure edible safety of crab paste and salted mudsnail, bacterial analysis of crab paste and salted mudsnail was conducted. Three bacterial strains were isolated from salted mudsnail and identified as Bacillus flexus, Aerococcus viridans and Brevibacterium casei. Similarly, 4 bacterial strains were isolated from crab paste and identified as Staphylococcus gallinarum, Moraxella catarrhalis, Micrococcus luteus and Photobacterium angustum. In addition, highly consistent results were observed between 16S rRNA analysis and MIS identification among these strains expect for Photobacterium angustum. Most bacterial strains exhibited faster growth with the increase of temperature. Six bacterial strains had significantly tardy growth under the condition of low-temperature refrigeration (4 ℃), indicating that low-temperature storage could inhibit bacterial growth and is suitable for the extension of shelf-life time. Seven bacterial strains had protease activity,Micrococcus luteus and Photobacterium angustum could not decompose starch, and all bacterial strains could not decompose ester. These bacterial strains could grow in the temperature range of 4 － 35 ℃ with the optimal temperature of 35 ℃, in the pH range of 5.0－9.0 with the optimal pH of 7.0, in the NaCl concentration range of 3%－7% with the optimal concentration of 3%.

salted mudsnail；crab paste；bacterial automatic identification；16S rRNA；PCR amplification

S984

A

1002-6630(2011)05-0217-04

2010-10-09

国家现代农业产业技术体系建设专项(nycy-47)；浙江省重中之重学科资助项目(XK0613040)；

浙江省教育厅重点资助项目(200517011)

黄键(1988—)，男，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：hj8862@126.com

*通信作者：苏秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向为食品科学、食品安全、生化与分子生物学。

E-m

ail：suxiurong@gmail.com