化妆品中铜绿假单胞菌检验方法探讨

陈冠武 苏建晖 陈冬娥 林宁静

(汕头出入境检验检疫局 广东汕头 515041)

化妆品中铜绿假单胞菌检验方法探讨

陈冠武 苏建晖 陈冬娥 林宁静

(汕头出入境检验检疫局 广东汕头 515041)

[目的]对4种鉴定方法进行比较分析,以找出适合于化妆品绿脓杆菌检验的准确快速的鉴定方法。[方法]同时采用微量生化管、API20NE试验条、VITEK-32和VITEK2 COMPACT微生物鉴定仪4种方法对不同类型的出口化妆品进行铜绿假单胞菌的检验、鉴定。[结果]5株可疑绿脓杆菌中有1株经手工鉴定为非绿脓杆菌,经API20NE试验条鉴定得出结果是恶臭假单胞菌,而VITEK-32和VITEK2 COMPACT微生物仪器鉴定是铜绿假单胞菌;其余4株用4种方法鉴定,结果均为绿脓杆菌。[结论]在鉴定可疑绿脓杆菌时,手工生化方法只能得出是或否的结论;API20NE试验条可得出具体的种属名称及鉴定分析;VITEK微生物仪器则可能出现误判。

铜绿假单胞;鉴定;分析

1 前言

绿脓杆菌(P.aeruginosa)属假单胞菌属(Pseudomonas),常引起人体皮肤化脓感染,特别是皮肤有外伤及眼部疾病患者感染绿脓杆菌后,常使病情恶化,严重者可引发败血症。因此,1987年5月发布的国家化妆品卫生标准GB/T 7918.4-87《化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌》[1]规定在化妆品中不得检出绿脓杆菌。由于受当时技术水平的限制,GB/T 7918.4-87对可疑绿脓杆菌的鉴定仅停留在应用生化管方面,而近年来,法国生物梅里埃推出API系列试验条、VITEK微生物鉴定仪及系列鉴定卡,已在各检测机构得到广泛应用[1]。本文对检验中可疑绿脓杆菌的鉴定同时采用微量生化管、API 20NE试验条、VITEK-32和VITEK2 COMPACT微生物鉴定仪4种方法进行鉴定,并对鉴定结果进行比较、分析。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样品

2006-2009年汕头口岸进出境的化妆品,共计5300批7000多份样品。

2.1.2 主要试剂

SCDLP液体培养基、十六烷三甲基溴化铵、乙酰胺等培养基,革兰氏染液等:购自北京陆桥公司;绿脓杆菌微量生化鉴定管:购自广东环凯公司;氧化酶试剂、API 20NE试验条、VITEK GN/GN I测试卡:购自法国生物梅里埃公司。

铜绿假单胞菌标准菌株AS1.2031:购自中国微生物菌种保藏中心;ATCC27853,购自美国微生物菌种保藏中心。

2.1.3 仪器

VITEK-32型、VITEK 2 COMPACT:法国生物梅里埃公司产品。

2.2 检测方法

按GB/T 7918.4-87[2]检验并予以改进。

3 结果

3.1 检出菌株总数

从不同类别的5份化妆品样样品中检出了4株铜绿假单胞菌和1株恶臭假单胞菌,具体鉴定结果见表1。

表1 不同方法对化妆品的菌株检出情况

表1显示,微量生化管、API 20NE试验条与VITEK仪器均判定01-04号菌株为铜绿假单胞菌;05号菌株的鉴定结果有差异:VITEK仪器鉴定该菌株是铜绿假单胞菌;手工鉴定是非绿脓杆菌的革兰氏阴性杆菌;而API 20NE试验条,反应数据由APWEB(V1.2.1)软件分析得出结果是恶臭假单胞菌。

3.2 05号菌株与铜绿假单胞标准菌株的比较

05号菌株与铜绿假单胞标准菌株(06号菌株)用API20NE试验条和VITEK仪器的鉴定情况见表2。

表2 05号菌株与铜绿假单胞标准菌株的鉴定结果比较

3.2.1 05号菌株与铜绿假单胞标准菌株的API 20NE结果比对

按API20NE操作说明,05号菌株用API 20NE试验条检验,反应数据由APWEB(V1.2.1)软件分析,得出结果是99.6%恶臭假单胞菌,T值(0.96),没有不一致试验。铜绿假单胞标准菌株(06号菌株)得出结果是99.6%铜绿假单胞菌。二者比对,有NO3、GEL、MAN等5项生化项结果不同。

3.2.2 05号菌株与铜绿假单胞标准菌株的VITEK结果比对

使用VITEK-32型仪器鉴定,05号菌株与铜绿假单胞菌标准菌株(06号菌株)仅存在甘露糖发酵(dMAN)一生化项结果差异。使用VITEK 2仪器鉴定,二者比对,有APPA、dMAN(甘露醇)、GlyA(氨基乙酸酶)、lHISa(组氨酸同化)4项生化实验的结果存在差异,但结论都是铜绿假单胞菌。05号菌株在VITEK 2 COMPACT二次鉴定还出现一项生化(CMT)差别,第二次为阳性。

4 讨论

(1)检出的4株铜绿假单胞菌分别来自不同厂家、不同类别的4份化妆品,还有报道从消毒液中检出铜绿假单胞菌[3],说明铜绿假单胞菌在自然界分布广,对外环境的抵抗力和抗药性能力都较强,因此,在化妆品、食品中检测铜绿假单胞菌很有必要[4]。

(2)虽然某些铜绿脓假单胞菌如标准菌株ATCC27853,它在增菌液和选择性分离平板上会出现特定绿色素和芳香气味,但是在检验时是不能仅凭是否产生色素和气味作出判断。因为①铜绿脓假单胞菌菌型多,一些标准菌株及本文检出阳性菌株中的3株在增菌液和选择性分离平板上都没有出现特定的色素和气味;②不同类型样品也会影响增菌液的色素和气味。所以增菌液和选择性分离平板上的是否会出现的色素和气味不能做为唯一判断依据,凡是SCDLP增菌液出现混浊,十六烷三甲基溴化铵平板上生长浅黄或白色、扁平、表面光滑的菌落均应列为可疑菌进行后续鉴定。

(3)在国标中显示均可使用十六烷三甲基溴化铵和乙酰胺平板作为分离铜绿脓假单胞菌的培养基。但实践中发现乙酰胺培养基的选择性过强,活化好的标准菌株在乙酰胺平板上也生长不好,呈现受抑制状,经48h培养,菌落仍很小(≤0.5mm),没有明显特征,不易辨别[4],因此,不能单独选用乙酰胺培养基来分离铜绿假胞菌。

(4)对于SCDLP增菌液经37℃培养24h后出现菌液混浊的,在划线分离目标菌同时吸10mL混浊的增菌液加入90mLSCDLP培养液,于42℃培养24h,即二次增菌后再划线于十六烷三甲基溴化铵平板进行目标菌分离,这有利于目标菌在平板上成为优势菌而提高检出率。

(5)如果十六烷三甲基溴化铵平板上所出现的单个菌不多,可从二次增菌液(延长培养至48h或42℃培养24h)重新挑菌液和从平板上挑粘结成片的菌苔分别划线于十六烷三甲基溴化铵平板进行目标菌的单个分离。对于平板上可疑菌应多挑单个菌落进行分纯培养,可有效避免漏检。除此之外,绿脓杆菌在SCDLP增菌液增殖,培养18h-48h其菌量稳定维持在高水平[4],所以增菌液可延长培养至48h。

(6)辅助鉴定可选用API 20NE试验条,文中多个非绿脓杆菌是经API 20NE辅助鉴定,初步得出菌的类别。API鉴定结果经APWEB(V1.2.1)软件分析,除有鉴定%值外,还有T指数及不一致的试验作为结论的说明,可以较全面分析鉴定情况,有效避免误判。

(7)VITEK鉴定生化仪虽然准确性与可靠性很高,已被许多国家列入检验标准中予以应用,但是其鉴定结果受到多种因素的影响:如待检菌株不纯;接种浊度不合要求;接种物孵育时间过长;超出试验卡鉴定范围;VITEK在扫描过程中出现了不正常读数等[5-7];甚至出现同一可疑菌仅出现一项对被检菌不是十分重要的生化项不同就得出不同结论(如表2所述的CMT)。除以上原因外,可能还有一些不能确定的因素也可导致其与手工生化结果不同的情况出现,这次05号菌株的鉴定就属于这种较难分析的异常情况。这说明VITEK生化鉴定仪器确实存在着一定几率的不正常鉴定情况[6],尽管这种几率可能非常低,但在实际检测工作中应该引起足够的重视:即不能过份依赖仪器鉴定细菌,对仪器鉴定报告要进行充分科学分析,生化卡上没有的项目(如MR-VP,OXI、靛基质和绿脓色素等),只要是目标菌规定检验的生化项目就应以手工生化鉴定确认;实验室应建立切实可行的仪器鉴定与手工方法相结合的细菌鉴定工作指导书,不能单凭着生化鉴定仪器鉴定报告结果就作出最终判定结论。

(8)生化鉴定时要运用阴、阳性对照比对[8]以及手工鉴定的平行比对(如不同厂家的生化管),以获得准确的分析结果。例如氧化酶试验,在绿脓杆菌检验中较重要,氧化酶阴性菌株即可认定非绿脓杆菌,但试剂1%二甲基对苯二胺在使用过程存在较高不稳性[8],尤其是国内试剂更是如此,另外操作上也存在易引起假阳假阴的因素,因此,这样的试验必须用已知氧化酶阳性和阴性的菌株同时做验证与试验结果加以比对。

(9)做好室内质控工作,比如培养基性能验证。实践中,曾出现一瓶开瓶较久的十六烷三甲基溴化铵培养基(在有效期内),用活化后的标准菌株进行培养基验证时发现标准菌株生长明显受影响,经48h培养,长成菌落量少、形态也较差。如果将此培养基应用到样品检验上,极易导致漏检,所以做好室内质控工作对保证检验结果准确性至关重要,发现培养性能不理想的培养基、试剂应及时淘汰(尽管还在有效期内),避免因培养基低性能导致漏检或误判。

[1] SN/T 2099-2008进出口食品中绿杆菌检测方法[S].

[2] GB/T7918.4-87化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌[S].

[3] 白梅.学校卫生所消毒液中检出绿脓杆菌[J].中国卫生检验杂志,2005,1(15):119-120.

[4] 郑晶,马聘.食品中绿杆菌检测方法的研究[J].食品科学,2007,28(7):419-424.

[5] 钟步云,孔海深,徐林燕,等.鉴定仪出现不能鉴定细菌的处理[J].中华医学检验杂志,2000,6(23):30-31.

[6] 黎昊雁,王玮,等.使用VITEK检测化妆品中的绿脓杆菌[J].中国卫生检验杂志,2005,15(1):100-101.

[7] 陈太基,封幼玲,戴建华,等.VITEK全自动微生物分析系统的应用与研究[J].中国卫生检验杂志,1997,7(5):262-266.

[8] 韩丽.绿脓杆菌检测的方法及注意事项[J].中国纤检,2006,5:16.

Discussion of Detection and Identification of Paeudomonas Aeruginosa in Comestics

Chen Guanwu,Su Jianhui,Chen Donge,Lin Ningjing

(Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shantou,Guangdong,515041)

According to National Standard GB/T7918.4-87,we recently detected 4 Paeudomonas aeruginosa and several Pseudomonas putida in various comestics.This article compared the adoption of Cetrimide Agar,and Acetamide Agar with chemical tubes,API20NE and VITEK,analysing and discussing the results produced by different methods.

Paeudomonas Aeruginosa;Identification;Analysis

T974.1