超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中7种氨基甲酸酯类农药残留

邓立刚，李增梅，郭长英，赵善仓，王玉涛，毛江胜

(农业部食品质量监督检验测试中心(济南)，山东省食品质量与安全检测技术重点实验室，山东 济南 250100)

超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中7种氨基甲酸酯类农药残留

邓立刚，李增梅，郭长英，赵善仓，王玉涛，毛江胜

(农业部食品质量监督检验测试中心(济南)，山东省食品质量与安全检测技术重点实验室，山东 济南 250100)

建立蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的超高效液相色谱-串联质谱联用的确证方法。样品经乙腈提取后，氨基柱净化，采用UPLC-MS/MS正离子模式下选择多反应监测(MRM)扫描测定。7种氨基甲酸酯类农药在5～200μg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.9977～0.9999。在0.01～0.10mg/kg添加范围内，回收率范围在72.1%～110.2%之间，相对标准偏差为1.7%～9.4%，方法的最低检出限为0.5～8..0μg/kg(RSN=10)。该方法操作简单、灵敏、准确度高，完全可满足蔬菜中多种氨基甲酸酯类农药残留量的测定及确证工作的需要。

氨基甲酸酯；超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)；蔬菜；农药

氨基甲酸酯类农药(carbamate pesticides)是以甲酸酯为前提化合物开发的一类广谱杀虫剂，具有易分解、残留期短、高效、选择性强等特点[1-2]。作为高毒有机氯农药的替代品，氨基甲酸酯类农药被世界广泛应用，它是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性而引起神经递质乙酰胆碱的积累，造成神经功能的紊乱，其在蔬菜上的过量残留或长期暴露在环境中会对人们的身体健康造成一定的危害[3-4]。国际上对氨基甲酸酯在蔬菜上的残留限量(MRL)制定较为严格的限量要求。

对于氨基甲酸酯的残留检测方法已有许多报道，主要是气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-荧光法(HPLC-FLD)、液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)等[5-16]，但氨基甲酸酯极性强、热稳定性较差，采用GC分析较困难，目前应用最为广泛的检测方法是HPLC-FLD方法，该方法灵敏度高，选择性强，但是在实测样品中，由于基质不同，个别蔬菜种类有较强干扰，无法做出进一步的确证。本实验探讨蔬菜中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、3-羟基克百威、涕灭威、克百威和甲萘威7种农药的残留分析，以期为蔬菜中多种氨基甲酸酯类农药的分析确证工作提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白菜、黄瓜、芹菜 市售。

甲醇、乙腈(色谱纯) 美国Merck公司；二氯甲烷(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；醋酸铵(优级纯) 德国Sigma公司；氨基甲酸酯类标准品储备液(1000 μg/mL) 农业部环境质量监督检验测试中心。

1.2 仪器与设备

ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色谱系统、Micromass Quattro UltimaIMPT 质谱仪(配有电喷雾离子源(ESI)及Masslynx 4.0数据工作站) 美国Waters公司；WERLE T25BS2型高速分散匀浆机 德国IKA公司；Laborata 4000型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；JNC N-EVAPTM112型氮吹仪 美国Organomation 公司；AccuBOND Amino 500mg/6mL Cartridge固相萃取小柱。

1.3 样品前处理

称取试样25.0g(精确至0.1g)样品于广口瓶中，准确加入100mL乙腈，高速匀浆1min，过滤至盛有5g氯化钠的具塞量筒中，剧烈振荡，静置20 min至分层，准确吸取乙腈相20mL于圆底烧瓶中，50℃水浴旋转蒸发至近干，加入2.0mL二氯甲烷-甲醇溶液(98:2，V/V)溶解，待净化。1.4 样品净化

将10mL二氯甲烷-甲醇溶液(98:2，V/V)预洗氨基固相萃取柱，待溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，20mL离心管收集洗脱液，用2.0mL二氯甲烷-甲醇溶液(98:2，V/V)洗涤圆底烧瓶，转移至固相萃取柱，重复2次。将收集的洗脱液置氮吹仪上，氮吹蒸发至近干，用甲醇-1mmol/L醋酸铵溶液(60:40，V/V)定容至2.0mL，0.2μm滤膜过滤，待测。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.5.2 质谱条件

大气压电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；毛细管电压3.2kV；离子源温度110℃；锥孔气流量75L/Hr；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量450L/Hr；光电倍增器电压650V；碰撞室真空度1.08×10-3(mbar)；质量分析器真空度：2.90×10-5(mbar)。定性离子对、定量离子对、碰撞电压和锥孔电压等质量条件参数详见表2。

表2 氨基甲酸酯类农药的MRM条件Table 2 MRM parameters for the determination of carbamate pesticide residues

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

氨基甲酸酯类药物的HPLC分离通常采用C18等反相柱，本实验分别对反相分离柱进行比较，柱1为Waters SunfireTMC18(2.1mm×100mm，3.5μm)、柱2为Waters AtlantisORdC18(2.1mm×50mm，3μm)、柱3为Waters ACQUITY UPLCORBEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)进行比较，氨基甲酸酯类药物在柱3既可以得到相对较好的分离度，又可显著提高质谱的灵敏度，而且缩短了分析时间，节省试剂使用量，降低污染，故选择Waters ACQUITY UPLCBEHC18柱作为分离柱，结果见图1。

图1 氨基甲酸酯标准品色谱图Fig.1 Chromatograms of standard carbamates

2.2 流动相的选择

在纯水-甲醇组成的流动相中，农药的加合离子峰含有[M+H]+、[M+Na]+或[M+NH4]+，当向水相中加入1mmmol/L醋酸铵时，各种农药加合离子峰迅速提高，在电喷雾离子源ESI+方式下，对于各种农药加合离子丰度比较发现，涕灭威亚砜[M+Na]+>[M+NH4]+、涕灭威砜[M+H]+、灭多威[M+H]+>[M+Na]+、3-羟基克百威[M+H]+>[M+NH4]+>[M+Na]+、涕灭威[M+Na]+> [M+NH4]+>[M+H]+、克百威[M+H]+> [M+Na]+> [M+NH4]+、甲萘威[M+NH4]+> [M+H]+>[M+Na]+，故选择甲醇-1mmmol/L醋酸铵溶液溶液体系作为流动相，选取加合离子峰丰度较高且稳定的准分子离子峰作为母离子。

2.3 提取条件的研究

图2 氨基甲酸酯标准品和白菜样品图谱Fig.2 Chromatograms of standard carbamates and cabbage sample determined by HPLC-FLD

图3 涕灭威标准品A和白菜样品B色图谱Fig.3 Chromatograms of aldicarb standard and cabbage sample determined by UPLC-MS/MS

参照我国农业部标准NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸》，使用氨基甲酸酯柱后衍生方法，方法具有一定的选择性，且灵敏度能够满足日常检测要求，但是对于不同的样品基质，个别蔬菜类别的样品会产生干扰，造成假阳性，图2为液相色谱柱后衍生荧光法测定白菜样品的图谱，通过保留时间定性，样品中含有涕灭威疑似峰，图3为质谱法测定该白菜样品的色谱图，未发现涕灭威峰，结果表明，该样品不含涕灭威残留，质谱法测定结果更加可靠。

2.4 样品定溶液的确定

样品的定溶液会影响到药物在色谱柱中的分离行为和离子化的效率，分别选用不同比例的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-1mmol/L醋酸铵溶液，乙腈-醋酸铵溶液作为溶剂体系作为样品的定溶液，实验结果表明，使用甲醇-1mmol/L醋酸铵(60:40，V/V)水溶液作为样品定溶液，各种农药化合物的丰度较其他定溶液均有不同程度的增高，且峰形变好，故选择甲醇-1mmol/L醋酸铵(60:40，V/V) 水溶液作为最佳的样品定溶液。

2.5 线性关系、回收率、精密度和检出限

用甲醇-1mmol/L醋酸铵溶液(60:40，V/V)将标准储备液稀释成0.5～200μg/L一系列的标准溶液，作为标准工作液，在上述仪器条件下，注射个系列的标准工作溶液，以各组分质量浓度/(X，μg/L)为横坐标，以各组分定量离子的色谱峰面积Y为纵坐标进行线性回归计算，7种农药化合物在5～200μg/L范围内线性关系良好，相关系数为0.9977～0.9999。方法的最低检出限在0.5～8μg/kg(RSN=10)，结果见表3。

表3 线性方程、相关系数和检出限Table 3 Linear equations, correlation efficients and detection limits

对空白样品在0.01、0.05、0.1mg/kg 3个水平上进行的添加，每个平行重复6次，考察方法的回收率和精密度，按照本方法进行提取净化并测定。添加量、平均回收率和精密度，结果见表4。实验数据表明，在0.01～0.10mg/kg添加范围内，在甘蓝中回收率为72.1%～110.2%，实验室内测定的精密度(以相对标准偏差(RSD)表示)为1.7%～9.4%，其各项指标符合农药残留痕量分析要求。

2.6 实际样品测定

应用本方法检测蔬菜抽查样品150批，结果克百威超标样品4个，检出灭多威2批，但没有超过限量范围，合格率为97.3%。

表4 空白样品的回收率Table 4 Recovery rates of carbamate pesticide residues in spiked blank samples %

3 结 论

本实验建立超高效液相色谱-串联质谱联用法测定蔬菜中7种氨基甲酸酯类农药残留，甲醇-1mmol/L醋酸铵溶液梯度洗脱，在质谱的正离子模式下监测，最低检出限在0.5～8.0μg/kg之间，方法准确、选择性高，完全可以满足蔬菜中7种氨基甲酸酯类农药残留量的测定以及确证工作的需要。

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Determination of Carbamate Residues in Vegetables by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

DENG Li-gang，LI Zeng-mei，GUO Chang-ying，ZHAO Shan-cang，WANG Yu-tao，MAO Jiang-sheng
(Center of Food Quality Inspection and Testing, Ministry of Agriculture, Shandong Key Laboratory of Testing Technique for Food Quality and Safety, Jinan 250100, China)

A simultaneous determination method for 7 kinds of carbamate residues in vegetables was developed by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The samples was extracted with acetonitrile and cleaned-up by NH2 solid phase extraction (SPE) cartridges. The analytes were quantified by UPLC-MS/MS in a positive ion multiple reaction mode (MRM). An excellent linear relationship for 7 carbamate residues was observed in the concentration range of 5－200μg/L with the regression coefficients of 0.9977－0.9999. The average recovery rate of 7 carbamate residues in vegetables at the spiked level of 0.01－0.10 mg/kg was in the range of 72.1%－110.2% with relative standard deviation of 1.7%－9.4%. This developed method revealed a detection limit range of 0.5－8.0μg/kg (RSN = 10). Therefore, this developed method is characteristics of simple operation, high sensitivity and precision, which can meet the requirements for simultaneous determination of carbamate pesticide residues in vegetables for inspection and confirmation.

carbamate；ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；vegetables；pesticide

TQ450.2；TS207.5

A

1002-6630(2011)06-0221-04

2010-05-20

山东省科技攻关项目(2009GG20001021)

邓立刚(1978—)，男，助理研究员，硕士，研究方向为农产品质量安全检测。E-mail：deng_ligang@163.com