大孔树脂吸附纯化青钱柳叶三萜化合物

尹忠平，上官新晨,*，张月红，黎冬明，吴少福，陈继光

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西农业大学植物资源开发与利用研究室，江西 南昌 330045)

大孔树脂吸附纯化青钱柳叶三萜化合物

尹忠平1,2，上官新晨1,2,*，张月红2，黎冬明2，吴少福2，陈继光2

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西农业大学植物资源开发与利用研究室，江西 南昌 330045)

为得到纯度较高的青钱柳叶三萜化合物，采用大孔树脂吸附法对青钱柳叶三萜粗提物进行纯化研究。静态吸附实验结果表明，AB-8树脂对青钱柳叶三萜化合物吸附、解吸性能较好，比饱和吸附量为77.49mg/g，解吸率为85.44%，总回收率可达72.01%。AB-8树脂动态吸附-解吸实验表明：上柱流速增大，吸附率呈降低趋势；随着上柱液质量浓度增大，吸附率先升后降；95%乙醇洗脱效果较好，10BV为合理用量；随着洗脱流速增大，洗脱液峰浓度降低，洗脱率减小，综合考虑以1.5mL/min较为适宜。经AB-8树脂纯化后，三萜类物质纯度可达44.30%。

青钱柳；三萜化合物；大孔树脂；纯化

青钱柳(Cyclocarya paliurus(Batal.) Iljinsk)为我国特有的胡桃科青钱柳属单种属珍稀植物，主要分布于我国长江中下游地区，当地人将其叶制成降糖降脂保健茶饮用已有200多年历史，江西修水青钱柳降糖神茶系列产品还取得了中国原产地标记保护。研究表明，青钱柳富含三萜类、黄酮类、多糖类及微量元素等功能活性成分，具有降糖、降脂、抗肿瘤、抗氧化及提高免疫力等多种功能，是良好的天然保健食品资源[1-3]。研究已经证实，大多数三萜化合物都具有药理活性，如抗糖尿病[4]、抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]等，在医药和保健食品领域具有重要的应用价值。三萜化合物是青钱柳中一类重要的活性物质，具有降糖、降压等功能活性[8]，目前关于此类物质的研究报道较少。青钱柳叶三萜粗提物中含有多糖、蛋白质、黄酮等杂质，纯化难度较大。大孔树脂吸附纯化是20世纪70年代发展起来的一种新型纯化方法，具有吸附容量大、再生简单、稳定可靠等诸多优点，是分离纯化三萜类、黄酮类、多糖类等物质的重要方法[9]。本研究以大孔树脂吸附法对青钱柳三萜粗提物的纯化进行探讨，旨在为青钱柳资源的深度开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青钱柳叶采自江西省修水县，去除杂质和枝杆后，常压干燥，粉碎过60目筛备用。

AB-8、DM130、HPD100、HPD722 大孔树脂 沧洲宝恩吸附材料科技有限公司；D3520、D4020大孔树脂 南开大学化工厂；熊果酸标准品 中国药品生物制品检定所；所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-754紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；HF-2.5B超声循环提取机 北京弘祥隆生物技术开发有限公司；RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；QT-1旋涡混合器 上海琪特分析仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 三萜化合物检测

参照洪艳平[10]、凌庆枝[11]等的方法。检测标准曲线的绘制过程如下：精确吸取对照品熊果酸溶液(90μg/mL)200、400、600、800、1000、1200、1400、1800、2200μL，分别加入具塞试管，水浴挥干。分别加入50g/L香草醛-冰乙酸和高氯酸各0.3mL和1.0mL，混匀，70℃水浴15min，迅速冷却后加入4.0mL冰乙酸，于550nm波长处测定吸光度。测定回归方程为：y=0.0047x－0.0166，R2=0.9977，式中，y为吸光度，x为熊果酸量/μg。

1.3.2 三萜化合物提取

准确称量青钱柳叶干粉(60℃干燥至质量恒定)，石油醚脱脂(等体积脱脂2次)，挥干石油醚，以65%乙醇超声辅助提取30min，离心(3000r/min、10min)，同条件二次提取，合并各级提取液，真空浓缩得三萜化合物粗提物。

1.3.3 三萜粗提物纯化工艺流程

三萜粗提物水溶液→上大孔树脂层析柱→蒸馏水洗柱→不同乙醇溶液梯度洗柱→收集目标组分(以薄板层析，L-B显色鉴定[12])→真空浓缩干燥→纯化三萜化合物

1.3.4 树脂预处理

按厂家说明书进行处理。

1.3.5 静态吸附-解吸实验

1.3.5.1 静态吸附实验

准确称取经预处理后滤干水分的AB-8、DM130、HPD100、HPD722、D3520、D4020大孔树脂各1g，置于磨口三角瓶中，各加入45mL已测定质量浓度的三萜粗提物水溶液，置于恒温摇床中进行吸附(115r/min，28℃)，至上层液吸光度恒定时终止吸附，静置取上清液测三萜化合物质量浓度。

比饱和吸附量(Qe)/(mg/g)=(吸附前质量浓度－吸附后质量浓度)×吸附液体积/树脂质量

1.3.5.2 静态解吸实验

将按1.3.5.1节吸附饱和的树脂加入到60mL 95%的乙醇中，置于恒温摇床中进行解吸(115r/min，28℃)，至上层液吸光度恒定时终止解吸，静置取上清液测三萜化合物质量浓度。

1.3.6 动态吸附-解吸实验

1.3.6.1 动态吸附实验

准确称取经预处理后滤干水分的AB-8树脂，湿法上柱，蒸馏水平衡后进行动态吸附-解吸实验。取一定质量浓度的三萜粗提物水溶液，以1.25mL/min的流速上柱，每1BV为1单位收集流出液，测定其三萜类物质含量，至流出液质量浓度接近上柱液且基本恒定时停止上柱，以流出液体积为横坐标、三萜类物质质量浓度为纵坐标绘制动态吸附曲线。

取等量三萜粗提物水溶液，分别以原液、2倍稀释液、4倍稀释液、8倍稀释液以相同流速上柱，同条件洗脱，测定吸附纯化后的三萜类物质含量，以分析上柱液质量浓度对吸附效果的影响。

取等体积等质量浓度三萜粗提物水溶液，分别以0.75、1.5、2.25、3.0mL/min的流速上柱，同条件洗脱，测定吸附纯化后的三萜类物质含量，以分析上柱流速对吸附效果的影响。

1.3.6.2 动态解吸实验

准确称取经预处理后滤干水分的AB-8树脂，湿法上柱，蒸馏水平衡，以一定质量浓度的三萜粗提物水溶液上柱，至流出液三萜类物质质量浓度为上柱液的1/5时停止上柱，10BV蒸馏水冲洗，再以10BV的40%、60%、80%、95%乙醇梯度洗脱，以高效铝质薄板层析，L-B显色鉴定，比较各梯度洗脱液中三萜类物质的种类。

取以相同条件吸附的树脂柱，以10BV蒸馏水冲洗，10BV 40%乙醇洗脱去杂，再分别以20BV 60%、80%、95%、100%乙醇进行洗脱并测定洗脱液中三萜类物质的含量，以确定洗脱液乙醇体积分数。

吸附后完成冲洗的树脂柱，40%乙醇洗脱去杂，再以95%乙醇洗脱，每1BV为1单位收集流出液，测定三萜类物质含量，绘制洗脱曲线。以不同流速进行洗脱，绘制洗脱曲线，以确定优选洗脱流速。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂静态吸附性能比较及筛选

大孔树脂种类繁多，因极性、孔径、比表面积不同而对吸附液中各组分的吸附作用有强有弱，解吸的难易也有区别。选择合适的树脂是大孔树脂吸附纯化的第一步，也是其中的关键环节。本研究根据吸附纯化的基本原理，选择6种树脂进行实验，其中D3520和D4020为非极性，AB-8、HPD100和HPD722为弱极性，DM130为中等极性，以静态吸附法对树脂进行筛选。实验结果(表1)表明：非极性的D3520和D4020对青钱柳三萜的吸附率较低，总回收率明显低于弱极性和中等极性的树脂；相对来说，AB-8具有较好的吸附、解吸性能，比饱和吸附量为77.49mg/g，解吸率为85.44%，总回收率可达72.01%。因此，本实验选择AB-8树脂进行下一步的动态吸附-解吸实验。

表1 大孔树脂静态吸附性能比较Table 1 Comparison on static adsorption and desorption capabilities of different types of macro-porous resins

2.2 AB-8树脂动态吸附曲线

图1 AB-8树脂动态吸附曲线Fig.1 Dynamic adsorption curve of AB-8 resin

取6.070mg/mL的三萜粗提物水溶液，以1.25mL/min的流速上柱，每1BV为1单位收集流出液绘制动态吸附曲线，结果如图1所示。当上柱体积为3BV时，流出液的质量浓度为1.208mg/mL，接近上柱液质量浓度的1/5，达到了泄漏点质量浓度。因此，AB-8树脂吸附纯化6.070mg/mL青钱柳叶三萜粗提物水溶液的处理能力为3BV。当上柱体积达到12BV后，流出液的质量浓度趋于平稳，可以认为达到了树脂的饱和吸附点。为充分利用树脂的吸附能力，可采用循环上柱或多柱串联的形式纯化三萜类物质。

2.3 上样速度对吸附的影响

图2 不同上样流速时的吸附效果Fig.2 Effect of sample solution flow rate on adsorption efficiency of AB-8 resin

不同的上样速度，目标物与树脂的接触时间不同，吸附量也因此会发生变化。由图2可知，随着上样速度的增大，三萜类物质的吸附量呈下降的趋势，上样速度为0.75mL/min时吸附率较高。树脂对目标物的吸附需要一个扩散和接触的过程，上样速度过快，目标物与树脂还未来得及充分接触就已下移到下一个吸附层面，以致于很快通过层析柱流出柱外，这样就无法形成有效的吸附，同时造成谱带的扩散，影响分离效果。因此，以AB-8树脂纯化青钱柳叶三萜类物质时，应降低上样速度以提高吸附率，但上样速度太低会使得纯化效率很低，实际应用时可适当提高上样速度。

2.4 上样质量浓度对吸附的影响

图3 不同上样质量浓度时的吸附效果Fig.3 Effect of sample solution concentration on adsorption efficiency of AB-8 resin

实验结果(图3)表明，随着上样质量浓度的提高，三萜类物质的吸附率呈先升后降之势，以2.44mg/mL的吸附效果最好。从理论上讲，上样质量浓度越高，吸附率应该越高，因为质量浓度差越大越有利于扩散，但本实验结果却表明，在较低的质量浓度范围内增加质量浓度时吸附率升高，而大于一定质量浓度时增加质量浓度反而会降低吸附率，主要原因可能是上样液质量浓度太高时，黏度较大，会阻碍目标物扩散，从而降低吸附率。高侠等[13]、李淑珍等[14]也报道了随着上样质量浓度增加目标物吸附率先升后降的实验结果，冯颖等[15]认为，引起高质量浓度时吸附率下降的原因可能是杂质的竞争性吸附作用。

2.5 不同体积分数乙醇解吸液的解吸效果

图4 不同体积分数乙醇的解吸效果Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption efficiency of AB-8 resin

结果(图4)表明，40%乙醇洗脱液中基本上不含三萜类物质，而大部分吸附在树脂上的色素可被40%乙醇洗脱下来，因而三萜类物质与色素可得到较好的分离。60%、80%、95%和100%四种体积分数的乙醇解吸液中，随着乙醇体积分数的升高解吸率也呈现出升高的趋势，其中95%乙醇、100%乙醇的解吸率明显高于其他体积分数，解吸所得目标物的纯度差别不大。因此，从解吸率的角度考虑，应选用100%的乙醇作为洗脱剂，如果考虑到成本问题，也可以选用95%乙醇。

2.6 动态解吸曲线

图5 AB-8树脂动态解吸曲线Fig.5 Dynamic desorption curve of AB-8 resin

结果(图5)表明，以95%乙醇洗脱，质量浓度峰值出现在3～6BV，且峰形较尖、峰宽较小，其中以4BV时质量浓度最高，10BV后三萜质量浓度已经很小，大部分三萜在前10BV时已解吸。因此，10BV为合理的洗脱剂用量。

2.7 不同洗脱流速的洗脱效果

图6 不同解吸流速时的解吸曲线Fig.6 Desorption curve at different flow rates

选择0.75、1.50、2.25、3.00mL/min四种流速进行动态解吸实验，结果(图6)表明：随着洗脱流速的增加，解吸量呈下降的趋势；0.75mL/min与1.50mL/min的解吸量差异不明显，但二者均显著高于2.25mL/min和3.00mL/min；流速越低，洗脱峰质量浓度越高；10BV后曲线均较为平坦。综合考虑洗脱率和洗脱效率，1.5mL/min的洗脱流速较为合理。

2.8 纯化后三萜化合物的纯度

青钱柳叶三萜粗提物，经AB-8大孔树脂吸附、蒸馏水冲洗、40%乙醇冲洗去杂、95%乙醇洗脱、真空浓缩干燥，得到的纯化三萜化合物为棕黄色粉末或片状物，有光泽，纯度可达44.30%。

3 结 论

3.1 所选的6种供试大孔树脂中，AB-8对青钱柳叶三萜化合物具有较好的静态吸附、解吸性能，比饱和吸附量为77.49mg/g，解吸率为85.44%，总回收率可达72.01%，适用于青钱柳叶三萜类物质的纯化。

3.2 采用AB-8树脂动态吸附纯化青钱柳叶三萜化合物时，对6.070mg/mL粗提物水溶液的处理能力为3BV；为获得较好的吸附效果，应以较低流速上样；随着上样质量浓度的提高，三萜类物质的吸附率呈先升后降之势，2.44mg/mL的吸附效果较好；95%乙醇可获得较好的解吸效果，10BV为合理的解吸剂用量；洗脱流速越低，效果越好，综合考虑洗脱效率，1.5mL/min较为合理。

3.3 经AB-8树脂纯化后的青钱柳叶三萜化合物为棕黄色粉末或片状物，有光泽，纯度可达44.30%。

[1] 谢明勇, 谢建华. 青钱柳研究进展[J]. 食品与生物技术学报, 2008,27(1): 113- 121.

[2] 彼香香, 方升佐. 青钱柳次生代谢产物及其生理功能[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(28): 13612-13614.

[3] XIE Mingyong, LI Lei, NIE Shaoping, et al. Determination of speciation of elements related to blood sugar in bioactive extracts fromCyclocarya paliurusleaves by FIA-ICP-MS[J]. Eur Food Res Technol, 2006, 223(2): 202-209.

[4] GUTIERREZ R M P, SOLIS R V, BAEZ E G, et al. Hypoglycemic activity of constituents fromAstianthus viminalisin normal and streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Journal of Natural Medicines,2009, 63(4): 393-401.

[6] CHOI C W, JUNG H A, KANG S S, et al. Antioxidant constituents and a new triterpenoid glycoside fromFlos Lonicerae[J]. Arch Pharm Res,2007, 30(1): 1-7.

[7] BENSASSON RV, ZOETE V, BERTHIER G, et al. Potency ranking of triterpenoids as inducers of a cytoprotective enzyme and as inhibitors of a cellular inflammatory response via their electron affinity and their electrophilicity index[J]. Chemico-Biological Interactions, 2010, 186(2): 118-126.

[8] 舒任庚. 青钱柳植物化学成分研究简报[J]. 江西中医学院学报, 1996,8(2): 34.

[9] 赵海雯. 癞葡萄皂甙的分离纯化及降血糖功效研究[D]. 无锡: 江南大学, 2005: 31.

[10] 洪艳平, 尹忠平, 上官新晨, 等. 光皮木瓜总三萜化合物提取和含量测定[J]. 江西农业大学学报: 自然科学版, 2007, 29(2): 225-229.

[11] 凌庆枝, 高莉莉, 袁怀波, 等. 大孔树脂吸附纯化女贞子三萜类化合物的研究[J]. 广西科学, 2009, 16(4): 428-431.

[12] 纵伟. 大叶紫薇叶降血糖作用及机理的研究[D]. 无锡: 江南大学,2005: 23.

[13] 高侠, 黎云祥, 蔡凌云, 等. 大孔吸附树脂对白簕叶总皂苷的纯化工艺研究[J]. 中药材, 2009, 32(5): 780-784.

[14] 李淑珍, 李进, 杨志江, 等. 大孔树脂分离纯化黑果枸杞总黄酮的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(1): 19-24.

[15] 冯颖, 李天来, 孟宪军, 等. 大孔树脂纯化长白楤木叶皂苷及其生物活性研究[J]. 食品科学, 2009, 30(16): 158-161.

Purification of Triterpenoids fromCyclocarya paliurusLeaves by Macro-porous Resin Adsorption

YIN Zhong-ping1,2，SHANGGUAN Xin-chen1,2,*，ZHANG Yue-hong2，LI Dong-ming2，WU Shao-fu2，CHEN Ji-guang2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Laboratory of Plant Resources Exploitation and Utilization, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

In order to obtain triterpenoids with high purity fromCyclocarya paliurusleaves, macro-porous resin was used for purification. Results indicated that macro-porous resin revealed a static absorption mode. AB-8 resin had good adsorption capability on triterpenoids fromCyclocarya paliurusleaves, and its adsorption capacity, desorption rate and total recovery rate were 77.49 mg/g, 85.44% and 72.01%, respectively. Dynamic adsorption and desorption experiments of AB-8 resin suggested that the increasing flow rate of sample solution could result in the decrease of adsorption rate, and the increasing sample amount in resin could result in a pattern of initial increase and final decline for adsorption rate. A better elution efficiency was observed at the concentration of 95% ethanol, and 10 BV was reasonable dosage. Both peak concentration and desorption rate were declined with the increasing flow rate of eluent. The best flow rate was 1.5 mL/min. The purity of triterpenoids purified by AB-8 macro-porous resin was 44.30%.

Cyclocarya paliurus；total triterpenoids；macro-porous resin；purification

TQ028.15

A

1002-6630(2011)06-0061-05

2010-05-17

江西省科技支撑计划项目(2009BSB09100)；江西省自然科学基金项目(2007GZN0214)

尹忠平(1971—)，男，讲师，博士研究生，主要从事食品化学与营养研究。E-mail：yinzp2008@yahoo.com.cn

*通信作者：上官新晨(1962—)，男，教授，博士，主要从事植物资源开发与利用研究。E-mail：shangguanxc_818@sina.com