食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC检测方法的建立

杨大伟，刘云国 ，谭乐义，周裔斌，祝素珍，王建广，贾俊涛，姜英辉

(1.山东出入境检验检疫局，山东青岛266002;2.安徽农业大学，安徽合肥230000)

食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC检测方法的建立

杨大伟1，2，刘云国1，*，谭乐义1，周裔斌2，祝素珍1，王建广1，贾俊涛1，姜英辉1

(1.山东出入境检验检疫局，山东青岛266002;2.安徽农业大学，安徽合肥230000)

目的:建立食品中A型肉毒梭菌的快速检测方法。方法:应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术，以A型肉毒梭菌的A型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物，PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以非A型肉毒梭菌，产气荚膜梭菌等23株参考菌株做特异性实验;A型肉毒梭菌DNA稀释成不同梯度，做灵敏度实验。结果:与传统的检测方法相比，该方法具有很好的特异性，方法灵敏度较高，最低检出限可达到为111ng/tube。结论:该方法可以快速、准确检测A型肉毒梭菌，是食品中致病菌快速检测的新技术。

变性高效液相色谱，A型肉毒梭菌，PCR，检测

肉毒梭菌属革兰氏阳性厌氧菌，广泛分布于自然界中，水和土壤中的肉毒梭菌芽孢是造成其食物污染的主要来源［1］。肉毒梭菌代谢产生的肉毒神经毒素能够抑制神经末梢乙酰胆碱的分泌，导致运动神经和延脑麻痹，根据其抗原性分为A～G型7个型，其中与人类中毒有关的是A、B、E、F型，我国报告由肉毒毒素致病的大多为A型毒素［2－4］。目前实验室中常用的检测肉毒神经毒素的方法是基于抗原－抗体反应的针对毒素蛋白的检测、小鼠致死及中和实验、胶体金免疫层析法、常规的PCR检测等，操作比较复杂，工作量大［5］。目前分子生物学方法以及其他一些新技术则快速灵敏、特异性强，符合当前国内外对食品安全检测的要求。变性高效液相色谱(denaturing high—performance liquid chromatography，DHPLC)作为近几年才发展起来的新技术，在一些领域已建立了快速、自动化核酸分析新方法。利用样品分子通过离子对固定相亲和力的差异，在用流动相洗脱时，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移动速率不同而达到分离的目的［6］。本实验采用PCR结合DHPLC方法，为A型肉毒梭菌检测提供了一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所用菌种 详见表1;细菌基因组DNA小量纯化试剂盒、PCRmaster mix TIANGEN;乙腈 色谱纯，购自Honeywell公司。

表1 实验所用菌株

普通PCR仪 Eppendorf AG22331，德国;变性高效液相色谱仪 NAV－99.4500，Transgenomic公司，美国;电泳仪 北京六一仪器厂;凝胶成像系统Vilber Lourmat公司;高速离心机 Centrifuge TGL－16B，Eppendorf公司，德国。

1.2 实验方法

1.2.1 引物合成 以A型肉毒神经毒素基因作为靶基因，在NCBI网站上进行检索，选择适合的序列，运用PrimerPremier5.0软件设计引物设计特异性扩增引物，用于PCR－DHPLC检测的引物序列如下:

上游引物:5′－GTTAACATCAATAGTAAGGGGAAT－3′;

下游引物:5′－CCATAACCATTTCGCGTAAG－3′。

引物序列由上海英骏生物工程有限公司合成，预期扩增片段为222bp。

1.2.2 参考菌株模板DNA的建立 按传统的培养方法分别增菌培养表1中除肉毒梭菌外的20株参考菌株。取菌株的细菌培养液1mL，采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取细菌DNA，保存于－20℃备用以待检测，用于特异性实验。

1.2.3 特异性实验 以A型肉毒梭菌DNA作为阳性对照，以1.1中参考菌的20种细菌DNA作为阴性对照，按照1.2.4 PCR扩增条件和1.2.5 DHPLC分析条件进行病原菌的PCR、DHPLC特异性实验。

1.2.4 PCR扩增条件 PCR反应采用20L体系，经过优化得到的最佳反应体系:2×PCRMaster 10μL，引物10μmol/L 各1μL，模板DNA 2μL，加 ddH2O 补足20μL。

最佳反应条件:反应程序如下:

预变性: 94℃ 5min

变性: 94℃ 30s退火: 58℃ 60s延伸: }72℃ 60s 40个循环延长: 72℃ 5min保存: 4℃

1.2.5 DHPLC分析条件 色谱柱:PS.DVB＆C18DNASep色谱柱(4.6min×50mm，粒度3m);柱温:50℃;流动相:缓冲溶液A浓度为49.9%，缓冲溶液B浓度为 50.1%;流速:0.9mL/min;上样量:PCR产物5μL。

1.2.6 灵敏度实验 挑取在37℃培养24h的A型肉毒梭菌菌落，悬浮于3mL0.85%生理盐水中，10倍梯度稀释菌液进行平板计数，重复2次，取平均值确定其菌悬液浓度为7.6×106cfu/mL。采用试剂盒提取法制备模板DNA，提取得到的DNA模板10倍梯度稀释进行PCR－DHPLC检测，并将上述所得菌悬液10倍梯度稀释，浓度分别为:1:1.11×108ng/tube;2:1.11×107ng/tube;3:1.11×106ng/tube;4:1.11×105ng/tube;5:1.11×104ng/tube;6:1.11×103ng/tube;7:1.11×102ng/tube;8:1.11×101ng/tube，从而确定反应体系的灵敏度。

2 结果与讨论

2.1 特异性实验

取1.2.2所建立的参考菌株DNA模板进行PCR－DHPLC检测的特异性实验。图1为部分菌种的检测结果图谱。经PCR－DHPLC检测，在供试的23株参考菌株中，只有A型肉毒梭菌出现阳性吸收峰，其余所有菌株均呈阴性。实验结果表明，本研究自主设计的A型肉毒梭菌检测引物具有很好的检测特异性。

图1 A型肉毒梭菌特异性实验的PCR－DHPLC吸收峰图谱

2.2 灵敏度实验结果

将A型肉毒梭菌001的DNA提取液做10n倍比稀释进行PCR－DHPLC检测，并将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实验，并进行比对，如图2所示，实验结果表明，DHPLC的最低检出浓度为111ng/tube，故本研究所建立的方法有很好的检测灵敏度。

图2 A型肉毒梭菌灵敏度实验的PCR－DHPLC吸收峰图谱

3 讨论

常规的A型肉毒梭菌检测包括增菌和生理生化鉴定，既耗时又复杂，不宜做大批量样本的检测，随着生产规模的扩大，需要大通量的检测技术，传统的检测方法暴露出种种弊端。而在生产上，由于检测的时间长可能会导致影响产量和销量。常规PCR凝胶电泳检测技术虽然检测成本低，但结果仅靠凝胶上的条带大小判断，如果产物条带较弱，扩增片段大小相差不多时，很难通过肉眼得到准确结果。实时荧光PCR技术具有特异性强，灵敏度高等优势，却存在检测成本高、荧光探针保存时间短等不足［7－8］。

PCR结合DHPLC技术是新近发展起来的高灵敏度、高通量检测新技术，DNA样品自动注入，并在缓冲液的携带下流经DNA分离柱。根据待检菌的特有基因序列，设计 PCR引物进行扩增，结合DHPLC技术可分离核酸片段的特点，达到快速、高通量检测菌的目的［9－10］。本文利用DHPLC能够吸收检测DNA片段并具有高度敏感性的特点，针对产A型肉毒神经毒素的特异基因序列进行PCR扩增，采用非变性DHPLC技术，然后利用DHPLC检测阳性吸收峰，一次可同时自动化分析数百个样本，达到快速检测的目的，具有广泛的实际应用价值。

［1］Gao Q Y，Huang Y F，Wu J G，et al.A review of botulism in China［J］.Biomed Environmental Sci，1990(3):326.

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［4］王颖群，严共华，雷祚荣.PCR检测产A、B、E、F和G型肉毒神经毒素梭菌的神经毒素基因［J］.中华微生物学和免疫学杂志，1997，17(3):182－184.

［5］杨慧盈，王慧，荫俊，等.A型肉毒神经毒素基因的PCR检测［J］.生物技术通讯，2006，17(1):37－39

［6］曹际娟，闫平平，于珂，等.变性高效液相色谱检测霍乱弧菌［J］.辽宁师范大学学报，2008，31(3):348－352.

［7］曹际娟，赵昕，孙哲平，等.PCR结合变性高效液相色谱快速检测水产品中河流弧菌［J］.中国卫生检验杂志，2008，18(11):2187－2189.

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［9］徐君怡，曹际娟，郑秋月，等.变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌［J］.生物技术通报，2009(3):127－131.

［10］徐君恰，曹际娟，郑秋月，等.变性高效液相色谱检测食品中致泻性大肠杆菌［J］.微生物学报，2008，48(11):1526－1531.

Denaturing high performance liquid chromatography
(DHPLC)used in the detection of Clostridium botulinum－A

YANG Da－wei1，2，LIU Yun－guo1，*，TAN Le－yi1，ZHOU Yi－bin2，ZHU Su－zhen1，WANG Jian－guang1，JIA Jun－tao1，JIANG Ying－hui1
(1.Shandong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China;2.Anhui Agriculture University，Hefei 230000，China)

Objective:Quick checking method of Clostridium botulinum was established by polymerase chain reaction(PCR)and denaturing high－performance liquid chromatography(DHPLC).Methods:With gene of Clostridium botulinum’type A botulinum neurotoxin as target gene，the primer was designed and PCR system was optimized.And the twenty－three test strains such as Clostridium perfringens were tested by specific detection.Then different grades of standard strain were obtained by diluting and sensitivity was detected.Results:The PCR－DHPLC methods could test Clostridium botulinum exclusively and sensitively which with the lowest amount of detecting was111ng/tube.Conclusion:The PCR－DHPLC method was rapid and accurate in detection of Clostridium botulinum in food.

DHPLC;Clostridium botulinum－A;PCR;detection

TS207.3

A

1002－0306(2011)06－0398－03

2010－04－21 *通讯联系人

杨大伟(1984－)，男，硕士在读，研究方向:农产品贮藏与加工。

国家质检总局课题(2008IK140，2009IK170)。