黑莓果实多酚超声提取工艺的响应曲面优化

赵慧芳，居正英，李维林，吴文龙，崔恩惠，屈乐文

(江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京210014)

黑莓果实多酚超声提取工艺的响应曲面优化

赵慧芳，居正英，李维林*，吴文龙，崔恩惠，屈乐文

(江苏省中国科学院植物研究所，江苏南京210014)

为了提高黑莓果实多酚的提取率，采用响应曲面法对多酚超声提取的关键参数进行了优化，建立了多酚超声提取的总多酚和鞣花酸含量的二次多项数学模型，并分析了模型因子间的交互作用，验证了模型的有效性。结果表明，4因素对总多酚和鞣花酸提取的影响大小依次为乙醇浓度>料液比>提取时间>超声频率，实验所得黑莓果实多酚超声提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度为46.54%，料液比为1∶30，超声频率为24kHz，提取时间为33.68min，该条件下测得的黑莓果实总多酚含量为5.131mg·g－1，鞣花酸含量为0.1483mg·g－1。

黑莓，多酚，鞣花酸，超声提取，响应曲面

黑莓(Blackberry)为蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus L.)植物，原产北美［1］，是新兴第三代小果类果树。黑莓果实柔嫩多汁、酸甜爽口、风味独特、色泽艳丽，其鲜果和加工产品受到欧美消费者的青睐。江苏省中国科学院植物研究所已与1986年开始黑莓引种与利用研究，至2006年已成功引进了16个黑莓品种［2］。黑莓果实营养丰富，富含多酚类物质，具有较 强 的 抗 氧 化［3］、清 除 自 由 基［4］、抗 癌［5］、抗 突变［6］、预防动脉硬化等作用。研究表明黑莓果实的多酚类物质包括五倍子酸、咖啡酸、阿魏酸、鞣花酸、儿茶酸、表儿茶酸、对香豆酸等，其中鞣花酸含量较高，约占总多酚含量的6%～10%［7］。据Ross H.A.等对树莓果实鞣花酸提取物的研究，发现树莓果实鞣花酸具有抗癌作用，对癌细胞具有防治作用［8］。因此，进行黑莓果实多酚类物质的开发和利用研究，具有重要的意义。本实验通过响应曲面法优化黑莓果实多酚的超声提取工艺，以测得的果实总多酚和鞣花酸含量为考核指标，研究了乙醇浓度、料液比、超声频率、提取时间4个因素对黑莓果实多酚提取效果的影响，进而确定了最佳提取工艺，对黑莓果实多酚类物质的开发和利用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑莓Boysen冻果 2009年6月4日采于江苏省中国科学院植物研究所黑莓品种园，－18℃速冻保存;没食子酸、Folin－Ciocalteu’s试剂、碳酸钠、乙醇、鞣花酸标准品 均为分析纯。

WP 700TL23－k5Galanz微波炉，EX－200A 型电子天平，PHILIPS飞利浦搅拌机HR2838，TU－1810紫外可见分光光度计，PL－5－B型低速离心机，KQ－100DE数控超声波清洗仪。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 取黑莓冻果200g，微波解冻后打浆，精确称取果浆4.000g于150m L锥形瓶中，按实验设计的条件加入提取溶剂，进行超声提取，提取温度为40℃;提取完成后，4000 r/m in离心10m in，取上清液定容至200m L，分别测定其总多酚和鞣花酸含量。

1.2.2 总多酚含量 Folin－Ciocalteu 法测定［9－10］。

1.2.2.1 标准曲线制作 准确称取0.5000g没食子酸，用纯净水溶解，并定容至1000m L，分别移取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、9.0、10.5、12.5、14.5m L 到 50m L容量瓶中，加水定容。分别取不同浓度的标准溶液1.0m L，加入 5.0m L 0.2mg·L－1Folin－Cioealteu’s试剂进行混合;在0.5～8min内，加入4m L 7.5%(w/v)饱和碳酸钠溶液，充分混合。将上述标准溶液在25℃下避光放置2h后，在765nm波长下测定吸光值。以吸光度Y为纵坐标，没食子酸浓度X为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程:y=0.01089x－0.23431，R2=0.9989。

1.2.2.2 样品测定方法 样品液稀释4倍进行测定。测定方法同上，根据回归方程计算样品总多酚的含量。

1.2.3 黑莓果实鞣花酸含量测定［11－12］

1.2.3.1 标准曲线绘制 准确称取0.1000g鞣花酸标准品用 35m L 0.1moL·L－1NaOH溶解，定容至1000m L，分别移取 0.5、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5m L 到100m L容量瓶中，加水定容。取不同浓度的标准溶液，分别测定其在357nm下的吸光度，以吸光度Y为纵坐标，鞣花酸含量X为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程:y=0.04044x+0.01324，R2=0.9960。

1.2.3.2 样品含量测定 样品液稀释10倍后进行测定，以水为空白，测定357nm下的吸光度。根据回归方程计算样品鞣花酸的含量。

1.2.4 黑莓果实多酚超声提取的响应曲面实验 根据现有的实验条件和单因素实验结果，确定实验的因素与水平，应用Design expert 7.0Trial设计软件进行响应曲面实验设计，以乙醇浓度、料液比、超声频率(以总功率的百分比记，超声仪器总功率为40kHz)、提取时间4个因子为自变量，分别以X1、X2、X3、X4表示，以总多酚含量和鞣花酸含量为响应值进行分析［6－11］，分别以 Y1和 Y2表示。具体因素与水平见表1。

表1 实验自变量因素编码及水平

2 结果与分析

2.1 回归分析

根据表1中的实验因素与水平的设计进行了29次实验，实验结果见表2。对表2的实验数据进行回归分析，得二次多元回归方程(模型)为:

表2 响应面实验设计结果

对该模型进行方差分析，结果见表3，由表3可以看出，总多酚含量 F回归=13.62>［F0.05(14，4)=5.87］，P值＜0.0001表明模型极显著;鞣花酸含量F回归=9.85>［F0.05(14，4)=5.87］，P 值 ＜0.0001表明模型极显著。总多酚含量F失拟=0.53≤［F0.05(14，10)=4.60］，失拟项P=0.8095>0.05，表明失拟不显著;鞣花酸含量 F失拟=0.73 ＜ ［F0.05(14，10)=4.60］，失拟项P=0.6873>0.05，失拟也不显著。总多酚含量回归模型的调整确定系数R=0.8632，说明该模型能解释86.32%响应值的变化，拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对超声提取黑莓果实多酚类物质进行总多酚含量的分析和预测;鞣花酸含量回归模型的调整确定系数R=0.8157，说明该模型能解释81.57%响应值的变化，模型拟合程度良好，实验误差小，可以用此模型对超声提取黑莓果实多酚类物质进行鞣花酸含量的分析和预测。

表3 回归模型方差分析

表4 回归方程系数显著性检验

对回归方程系数进行显著性检验，结果见表4，总多酚含量模型中的一次项X1、X2和二次项0.0001)极显著，一次项X3、交互项X2X4、二次项显著;鞣花酸含量模型中的一次项X1、X2和二次项P＜0.0001)极显著，二次项和X(P＜0.05)显著。说明乙醇浓度和料液比对总多酚和鞣花酸的提取含量的主效应明显，且料液比和提取时间对总多酚含量有交互作用的影响。根据回归系数估计值可知，影响因子的主效应主次顺序为:乙醇浓度>料液比>提取时间>超声频率。

2.2 超声提取黑莓果实多酚类物质的响应曲面分析与模型优化

2.2.1 乙醇浓度和料液比对总多酚和鞣花酸含量的影响 从图1可以看出，料液比不变，随着乙醇浓度的增大，总多酚和鞣花酸的含量均呈增加趋势，但当乙醇浓度达到一定值，总多酚含量变化平缓，后继呈现下降趋势;当乙醇浓度恒定，料液比越高，多酚含量越高，且在乙醇浓度较低的区域，提高料液比有利于总多酚和鞣花酸含量的提高。

2.2.2 乙醇浓度和超声频率对总多酚和鞣花酸含量的影响 从图2可以看出，超声频率不变，随着乙醇浓度的增大，总多酚和鞣花酸含量呈增加趋势，但当乙醇浓度达到40%以上时，总多酚和鞣花酸含量变化平缓，后继呈现下降趋势;当乙醇浓度恒定，随着超声频率的增大，总多酚和鞣花酸含量有小幅度增加，但当超声频率达到60%以上时，总多酚和鞣花酸含量变化平缓，后继呈现下降趋势。

图1 乙醇浓度与料液比对总多酚和鞣花酸含量的影响

2.2.3 乙醇浓度和提取时间对总多酚和鞣花酸含量的影响 从图3可以看出，提取时间不变，随着乙醇浓度的增大，总多酚和鞣花酸含量呈升高趋势，但当乙醇浓度达到35%～50%时，总多酚和鞣花酸含量变化平缓，乙醇浓度高于50%时略有下降;当乙醇浓度恒定，随着提取时间的延长，总多酚和鞣花酸含量逐渐增加，但当提取时间达到25min以上时，总多酚含量和鞣花酸含量变化平缓并略有下降趋势。

图2 乙醇浓度与超声频率对总多酚和鞣花酸含量的影响

图3 乙醇浓度与提取时间对总多酚和鞣花酸含量的影响

图4 超声频率与料液比对总多酚和鞣花酸含量的影响

2.2.4 料液比和超声频率对总多酚和鞣花酸含量的影响 从图4可以看出，超声频率不变，随着料液比的增大，总多酚和鞣花酸含量呈升高趋势，当料液比达到1∶25以上时，总多酚和鞣花酸含量变化平缓;当料液比恒定，随着超声频率的增大，总多酚和鞣花酸含量逐渐升高，前者升高的幅度显著大于后者，总多酚含量在超声频率大于总功率的70%后变化平缓，而鞣花酸含量在超声频率大于总功率的70%后则略有下降。2.2.5 料液比和提取时间对总多酚和鞣花酸含量的影响 从图5可以看出，提取时间不变，随着料液比的增大，总多酚和鞣花酸含量呈升高趋势，但当料液比达到1∶25之后，总多酚和鞣花酸含量变化平缓且略有下降，在提取时间较长的范围内提高料液比有利于总多酚和鞣花酸含量的提高;当料液比恒定，随着提取时间的延长，总多酚和鞣花酸含量逐渐增加，但当提取时间达到25min以上时，总多酚和鞣花酸含量变化平缓且后继略有下降，在料液比较高的区域内延长提取时间有利于总多酚和鞣花酸含量的提高。

图5 料液比与提取时间对总多酚和鞣花酸含量的影响

2.2.6 超声频率和提取时间对总多酚和鞣花酸含量的影响 从图6可以看出，提取时间不变，随着超声频率的增大，总多酚和鞣花酸含量呈升高趋势，但当超声频率达到60%之后，总多酚和鞣花酸含量变化平缓，且后继略有下降，在提取时间较短的范围内提高超声频率有利于总多酚含量的提高;当超声频率恒定，随着提取时间的延长，总多酚和鞣花酸含量逐渐增加，但当提取时间达到30min以上时，总多酚含量变化平缓，而鞣花酸含量则略有下降，在超声频率较低的区域内延长提取时间有利于总多酚和鞣花酸含量的提高。

图6 超声频率与提取时间对总多酚和鞣花酸含量的影响

综合图1～图6的变化规律可得出如下分析结果:a.在料液比、超声频率和提取时间不变的情况下，乙醇浓度选择在40%～60%的范围内总多酚和鞣花酸含量较高;b.在乙醇浓度、超声频率和提取时间不变的情况下，料液比选择在1∶25～1∶30范围内总多酚和鞣花酸含量较高;c.在乙醇浓度、料液比和提取时间不变的情况下，超声频率在50%～80%的范围内总多酚和鞣花酸含量最高;d.在乙醇浓度、料液比和超声频率不变的情况下，提取时间在25～35min的范围内总多酚和鞣花酸含量最高。

根据回归模型，超声提取黑莓果实总多酚和鞣花酸的最佳条件为:X1=46.54，X2=30，X3=62.26，X4=33.68，此时Y1=5.313;转化为实际参数，即在乙醇浓度46.54%，料液比1∶30，超声频率24kHz，提取时间33.68min的条件下，测得黑莓果实的总多酚含量高达 5.313mg·g－1，鞣花酸含量高达 0.1502mg·g－1。在该条件下，实验值Y1为5.131，Y2为0.1483，两者与预测值相差均小于5%。

2.3 模型的检验

为了进一步确定超声提取黑莓果实多酚类物质的最优工艺条件，利用Design Expert分析，优选出12组参数来验证。结果显示总多酚含量的平均相对误差为3.70% ±2.26%，鞣花酸含量的平均相对误差为3.85% ±2.52%，均低于5%，证明该模型能较好地评价超声法提取黑莓果实多酚的作用效果。

3 结论

超声波提取是利用超声波在液体中的空化、振动、扩散、击碎等作用加速植物有效成分的浸出，具有温度低、时间短、耗能低、提取率高等优点，避免提取过程中因热效应引起的有效成分结构变化、损失及生理活性的降低，广泛用于多种植物有效成分的提取。

本研究用超声提取的方法，从黑莓果实中提取多酚类物质，应用响应曲面法进行分析，对自变量:乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、超声频率(X3)、提取时间(X4)等4因素与因变量:总多酚含量(Y1)和鞣花酸含量(Y2)的数学模型进行了回归分析，数学模型极显著相关。黑莓果实多酚类物质的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度46.54%，料液比1∶30，超声频率24kHz，提取时间为33.68min，在此工艺条件下，测得黑莓果实的总多酚含量为5.131mg·g－1，鞣花酸含量为0.1483mg·g－1。经检验证明该提取黑莓果实多酚类物质的工艺条件合理、可靠。

［1］吴文龙，顾姻.新经济植物黑莓的引种［J］.植物资源与环境学报，1994，3(3):45－48.

［2］吴文龙，李维林，闾连飞，等.黑莓、树莓在南京地区的引种研究［J］.江苏林业科技，2006，33(2):13－15.

［3］Tate P，God J，Bibb R，et al.Inhibition of metalloproteinase activity by fruit extracts ［J］.Cancer Letters，2004，212:153－158.

［4］Seeram1N P，Momin1R A，Nair M G，et al.Cyclooxygenase inhibitory and antioxidant cyaniding glycosides in cherries and berries ［J］.Phytomedicine，2001，8(5):362－369.

［5］Boateng J，Verghese M，Shackelford L，et al.Selected fruits reduce azoxymethane(AOM)－induced aberrant crypt foci(ACF)in Fisher344male rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2007，45:725－732.

［6］Elisia I，Hu C，Popovich D G，etal.Antioxidantassessment of an anthocyanin－enriched blackberry extract［J］.Food Chemistry，2007，101:1052－1058.

［7］Sellappan S，Casimir C Akhon，Krewer G.Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity of Georgia－Grown Blueberries and Blackberries ［J］.Agricultural Food Chemistry，2002，50:2432－2438.

［8］Ross H A，McDougall G J，Stewart D.Antiproliferative activity is predominantly associated with ellagitannins in raspberry extracts［J］.Phytochemistry，2007，68:218－228.

［9］Singleton V L，Rossi JA.Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic－phosphotungstic acid reagents ［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1965，16:144－158.

［10］李静，聂继云，李海飞，等.Folin－酚法测定水果及其制品中总多酚含量的条件［J］.果树学报，2008，25(1):126－131.

［11］陈笳鸿，吴冬梅，汪咏梅，等.紫外分光光度法测定鞣花酸含量的研究［J］.生物质化学工程，2001，41(3):18－20.

［12］晋艳曦.葡萄汁中鞣花酸的定性与定量分析［J］.饮料工业，1995，2(5):33－36.

Optim ization of ultrasonic extraction process of polyphenols from blackberry fruit by using response surface analysis

ZHAO Hui－fang，JU Zheng－ying，LIW ei－lin*，WU W en－long，CUIEn－hui，QU Le－wen
(Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210014，China)

Response surfacem ethodology was adopted to study the optim ized param eters in order to increase the yield of blackberry fruit polyphenol.The m odels of second order quadratic equation for total polyphenol and ellagic acid contentwere built.The interaction involved factorswere analyzed，and adequacy of themodel equations for predicting the optimum response values was verified.The results indicated that the effect orders of four factors on polyphenol yield were as follow:ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction time and ultrasonic frequency.The optim ized technology parameters were ethanol concentration of 46.54%，solid－liquid ratio of 1∶30，ultrasonic frequency of 24kHz，extraction time of 33.68m in，and under these conditions the content of total polyphenol was up to 5.131mg·g－1，the content of ellagic acid was up to 0.1483mg·g－1.

blackberry;polyphenol;ellagic acid;ultrasonic extraction;response surfacemethodology

TS201.1

B

1002－0306(2010)06－0299－05

2010－06－01 *通讯联系人

赵慧芳(1984－)，女，研究实习员，硕士，主要从事黑莓等植物功能性营养物质的研究与利用。

江苏省农业高科技项目(BG2007311);江苏省科技基础设施建设计划项目(BM2009041)。