变性剂及表面活性剂对蛤蟆油粘度影响的研究

张 梅，赵 雨，*，李芸彤，刘诗超，曲晓波

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117;2.延边大学药学院，吉林延吉133000)

变性剂及表面活性剂对蛤蟆油粘度影响的研究

张 梅1，赵 雨1，*，李芸彤1，刘诗超2，曲晓波1

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117;2.延边大学药学院，吉林延吉133000)

研究了变性剂及表面活性剂对蛤蟆油粘度的影响，以蛤蟆油粘度为评价指标，考察不同浓度的尿素、盐酸胍、β－巯基乙醇、SDS、Triton等变性剂及表面活性剂对蛤蟆油粘度的影响。实验结果表明，当尿素、盐酸胍、β－巯基乙醇、Triton、SDS浓度分别为7mol/L、0.2mol/L、3%、2g/mL及8%时，具有最低粘度，其中盐酸胍的作用效果最佳。实验结果为进一步研究其有效成分、提取分离方法及药理活性奠定了基础。

蛤蟆油，粘度，变性剂，表面活性剂

哈蟆油(Oviduetus Ranae)，系蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinesis David)雌蛙的输卵管，经采制干燥而得［1］，又名哈什蟆油、田鸡油、蛤蚂油等［2］，是我国东北特产的名贵中药材，具有补肾益精、养阴润肺等功效［3］。蛤蟆油含有蛋白质、固醇类物质、不饱和脂肪酸、维生素与微量元素等多种化学成分，有很高的药用、营养价值，在国际市场上价格昂贵，有“软黄金”之称。由于其含有大量的糖蛋白［4］，导致其遇水溶胀后呈粘稠状，不利于有效成分的提取和鉴定，本文考察了尿素、盐酸胍、β－巯基乙醇、SDS(十二磺基硫酸钠)、Triton(曲拉通)等对其粘度的影响，为进一步研究蛤蟆油的理化、性质、分离纯化有效成分及开发产品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

哈蟆油 购自于吉林省白山市北亚药业，经长春中医药大学姜大成教授鉴定为中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的干燥输卵管;盐酸胍、尿素、SDS、Triton、β－巯基乙醇 均购自于Sigma公司。

DV－Ⅱ+P型旋转粘度计 BROOKFIELD公司;C－MAG加热磁力搅拌器 德国IKA集团;TE212－L电子天平 梅特勒－托利多公司;DS－1高速组织捣碎机 上海标本模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 变性剂及表面活性剂作用于蛤蟆油 将哈蟆油原药材剥去筋膜血管等杂物，晾干后研磨成细粉。精确称取蛤蟆油45份，每份1.0g。按料液比1∶100加入蒸馏水，浸泡溶胀24h，匀浆3次，每次10s。分别考察尿素浓度(1、2、3、4、5、6、7、8mol/L)、盐酸胍浓度(1、2、3、4、5、6、7、8mol/L)、β－巯基乙醇浓度(v/v)(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)、Triton浓度(v/v)(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)和

1.2.2 蛤蟆油粘度的测定 采用Brookfield DV－Ⅱ+P型旋转粘度计测其粘度，选用LV－61号转子，在(25±0.1)℃室温条件下，测定转速为200r/min下测定，每个样品重复测定3次。

2 结果与讨论

2.1 尿素对蛤蟆油粘度的影响

由图1可以看出，随着尿素浓度的增加，蛤蟆油的粘度随之降低，当浓度增加到2mol/L时，粘度下降趋势明显，由1.586Pa·s下降到0.628Pa·s。继续增加到7mol/L时，粘度下降趋势较为平缓，由0.628Pa·s下降到0.266Pa·s;高于7mol/L时，蛤蟆油的粘度不再降低。这是因为尿素作为常用的变性剂，可与极性基团和非极性基团发生相互作用，从而降低其粘度。

图1 不同浓度尿素对蛤蟆油粘度的影响

2.2 不同浓度盐酸胍对蛤蟆油粘度的影响

由图2可以看出，随着盐酸胍浓度的增加，蛤蟆油的粘度随之降低，当浓度增加到0.05mol/L时，粘度急剧下降，由1.350Pa·s下降到0.056Pa·s。继续增加到0.2mol/L时粘度下降趋势不明显，由0.056Pa·s下降到0.017Pa·s。当浓度高于0.2mol/L时，蛤蟆油的粘度不再降低。这是因为盐酸胍作为一种强变性剂，主要是通过与蛋白质的官能团键合，从而间接引起蛋白质疏水基团周围水氢键结构的变化［5］，释放水分子，改善流动性，降低粘度。

图2 不同浓度盐酸胍对蛤蟆油粘度的影响

2.3 不同浓度β－巯基乙醇对蛤蟆油粘度的影响

由图3可以看出，随着β－巯基乙醇浓度的增加，蛤蟆油的粘度随之降低，当浓度增加到3%时，粘度下降趋势明显，由1.326Pa·s下降到0.302Pa·s;继续增加到8%时粘度几乎不降低。β－巯基乙醇对蛋白的变性作用主要是通过打断其结构中的二硫键，造成其空间结构发生变化［6］，说明其中含有大量的二硫键。

2.4 不同浓度Triton对蛤蟆油粘度的影响

由图4可以看出，随着Triton浓度的增加，蛤蟆油的粘度随之降低，当浓度增加到1%时粘度下降趋势明显，由1.326Pa·s下降到0.707Pa·s。继续增加到8%时粘度下降趋势不明显，由0.707Pa·s下降到0.608Pa·s。高于3%时，蛤蟆油的粘度几乎不降低。Triton是蛋白的良好溶剂，尤其对膜蛋白具有助溶作用。在以往的实验中，我们经常用这几种试剂来溶解难溶性蛋白，尤其是包涵体蛋白，说明他们在与蛋白作用改变其空间结构后，使其亲水性增强，进而溶解度增大，粘度降低。

图3 不同浓度β－巯基乙醇对蛤蟆油粘度的影响

图4 不同浓度Triton对蛤蟆油粘度的影响

2.5 不同浓度SDS对蛤蟆油粘度的影响

由图5可以看出，随着SDS浓度的增加，蛤蟆油的粘度随之降低，当浓度增加到10mg/mL时粘度下降趋势明显，由1.329Pa·s下降到0.146Pa·s。继续增加到40mg/mL时，粘度下降趋势不明显，由0.146Pa·s下降到0.083Pa·s。高于20mg/mL时，蛤蟆油的粘度几乎不降低。SDS可以使蛋白质分子内和分子间的氢键断裂，使分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构［7］。三种表面活性剂中SDS的作用最强，其中可能含有大量能与氢键作用的基团，为以后的实验提供理论依据。

图5 不同浓度SDS对蛤蟆油粘度的影响

3 结论

粘度作为流变学性质的一个重要指标，它的变化在一定程度上能反映出蛋白质分子物理化学特性和结构的变化［8］。因此，可以通过研究蛋白质在水溶液中折叠情况和变性机理来寻找降低粘度的方法［9］。

由实验结果可知，蛤蟆油形成交联的主要原因是由于其蛋白分子间存在大量的氢键、疏水键及二硫键，当加入变性剂或表面活性剂后，使上述分子键遭到不同程度的破坏，进而破坏其交联结构，导致其粘度降低。因此，为进一步研究蛤蟆油的理化、性质、分离纯化有效成分及开发产品奠定基础。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版一部)［M］.北京:化学工业出版社，2005:225.

［2］中国医学科学院药物研究所.中药志(Ⅵ)［M］.北京:人民卫生出版社，1961.

［3］胡鑫，刘成柏，陈晓平，等.林蛙油中主要营养保健成分含量的研究［J］.吉林农业大学学报，2003，25(2):218－220.

［4］范玉林，崔香顺，姚玉霞.哈士蟆油成分研究的进展［J］.吉林农业大学学报，1996，18(3):105.

［5］Watlaufer D B，M alik S K，Stoller L，et al.Am Chem Soc［J］，1964，86:508－515.

［6］木泰华，孙艳丽，菅野，等.β－乳球蛋白加压凝胶的生成及其物化特性研究［J］.中国农业科学，2005，38(8):1652－1657.

［7］张为灿，戴旭慧，赵越，等.十二烷基磺酸钠对大豆过氧化物酶活性和构象的影响［J］.化学学报，2008，66(6):669－674.

［8］罗永康，潘道东，沈慧星，等.蛋白质浓度、pH、离子强度对鲢鱼肌原纤维蛋白粘度的影响［J］.食品与发酵工业，2004，30(7):52－54.

［9］Chilom G，Chilom O，Telea C，et al.Rev Roumaine Chim［J］，2000，45:989－901.

Effect of denaturing agents and surfactants on viscosity of Oviduetus Ranae

ZHANG Mei1，ZHAO Yu1，*，LI Yun－tong1，LIU Shi－chao2，QU Xiao－bo1
(1.Center for New Medicine Research of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.College of Pharmacy，Yanbian University，Yanji 133000，China)

The factors of the viscosity of Oviduetus Ranae，including denaturing agents and surfactants，consisted of different concentrations of urea，guanidine hydrochloride，β－ mercaptoethanol，SDS and Triton were studied.Both denaturing agents and surfactants could reduce the viscosity，the best concentrations were 7mol/L，0.2mol/L，3%，2g/mL and 8%，respectively，in which the best was guanidine hydrochloride.The result provided a basis for further study on active ingredients，extractions and pharmacological activities of Oviduetus Ranae.

Oviduetus Ranae;viscosity;denaturing agents;surfactants

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0167－03

2010－05－13 *通讯联系人

张梅(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:蛋白质的结构功能研究及产品开发。

国家“十一五”科技支撑项目(2007BAI38B06)。SDS 浓度(2、3、4、5、10、20、30、40mg/mL)对蛤蟆油粘度的作用。