环境激素双酚A与蛋白质相互作用的电化学研究

王 辰，付艳丽，王 振，高云涛

(云南民族大学化学与生物技术学院民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650031)

环境激素双酚A与蛋白质相互作用的电化学研究

王 辰，付艳丽，王 振，高云涛

(云南民族大学化学与生物技术学院民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650031)

采用电化学法研究环境激素双酚A与牛血清蛋白的相互作用.实验表明牛血清蛋白存在使双酚A的氧化峰峰电流减小.双酚A在加入牛血清蛋白后参与反应的质子数和电子数都为2.牛血清蛋白与双酚A的结合数m=2，结合常数β=5.81×1010.由此推测双酚A进入牛血清蛋白的疏水空腔内，使游离双酚A浓度变小.

双酚A;牛血清蛋白;循环伏安法;相互作用

双酚A(BPA)是应用广泛的有机化工原料［1］，其化学结构式如图1.具有较强的类雌激素的作用，干扰人类和动物的正常内分泌功能［2－3］.近年来的研究表明，双酚A能改变遗传信息的某些基因，导致细胞的畸变，产生肿瘤［4］，具有致癌、致畸、致突变的毒性［4］.蛋白质是药物发挥药效的重要载体和靶分子，探讨BPA与蛋白质的相互作用对于在分子水平了解BPA的作用机制具有重要意义［5］.本文利用多壁碳纳米管(MWNT)［6－7］修饰玻碳电极(MWNT/GCE)研究了BPA与牛血清蛋白相互的作用，对二者之间的作用机理进行研究，为深入了解BPA类环境激素的生物毒性提供进一步的实验依据.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MEC－12B型多功能电化学分析系统(江苏江分电分析仪器有限公司).三电极系统:工作电极为修饰玻碳电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)，对电极为铂电极，超声波清洗器AS3120A.

双酚A(BPA，国药集团上海化学试剂有限公司)溶于乙醇配成2.0×10－3mol/L储备液;多壁碳纳米管(厦门大学提供);牛血清蛋白(BSA，北京元亨圣马生物技术研究所)，用2次重蒸水配成1.0×10－4mol/L储备液，4℃冰箱保存;KH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液.所用试剂均为分析纯，实验用水为2次重蒸水.

1.2 实验方法

1.2.1 MWNT/GCE的制备

将MWNT在浓HCl中超声72 h进行纯化，纯化后的MWNT加浓HNO3在140℃下回流8 h，用2次重蒸水洗至中性，在100℃烘干，研成粉末，经浓HNO3回流处理后的MWNT，在打开其端口的同时，引入羧基和羟基等官能团.

称取功能化的MWNT粉未10.0 mg，超声分散于10 mL 2次重蒸水中，形成黑色悬浊液备用.玻碳电极先用0.05 μm Al2O3抛光粉抛光成镜面，然后分别在无水乙醇和2次重蒸水中超声清洗5 min.用微量进样器取4 μL悬浊液滴加在玻碳电极表面，红外灯下烘干，即得MWNT/GCE.

1.2.2 循环伏安法(CV)分析

取一定量的BPA至10 mL比色管，加入KH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液，稀释至刻度后，转移至电解池中.采用三电极体系，在0.2～0.8 V电位范围内，以0.10～0.40 V/s的扫描速度进行循环伏安扫描，记录伏安曲线.

2 结果与讨论

2.1 电极的选择

用玻碳电极和多壁碳纳米管电极分别进行循环伏安扫描，以0.15 V/s的扫速速度在0.2～0.8 V范围内循环伏安扫描发现:BPA在玻碳电极上无氧化还原峰信号;在多壁碳纳米管电极上有一灵敏的氧化峰.因此，采用多壁碳纳米管电极作为工作电极.

2.2 支持电解质的选择

分别在HAc－NaAc，B－R，KH2PO4－Na2HPO4缓冲体系中进行测试，均会出现相应的氧化还原峰，但峰电位、峰形、峰电流大小不同.结果表明BPA在KH2PO4－Na2HPO4缓冲体系中峰形好，灵敏度高，实验选用KH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液为测定支持电解质.

2.3 缓冲溶液酸度的影响

在KH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液(pH 6.0～8.0)，BPA+BSA体系在不同pH条件下，峰电位不变，而峰电流却有不同程度的降低.电位Ep与pH的关系结果见图2，线性回归方程 Ep(V)=0.96－0.059 pH，r=0.995 6 .

2.4 反应时间对峰电流的影响

BPA与牛血清蛋白相互作用，随着二者反应时间的增加，峰电流有一定的增加(见图3).当相互作用20 min后，峰电流基本稳定.因此，选择BPA与牛血清蛋白相互作用时间20 min.

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2.5 扫描速度的影响

2.5.1 扫速对峰电位的影响

对1.0×10－5mol/L BPA和1×10－5mol/L BSA同时存在的溶液进行测定，观察扫速对峰电位的影响.结果表明，当扫速在0.10～0.40 V/s范围内变化时，峰电位均随扫速的增加而增加，且峰电位Ep与扫速的自然对数值lnv之间存在着良好的线性关系，线性方程Ep=0.462+0.0196 lnv，r=0.995 2.

2.5.2 扫速对峰电流的影响

对1.5×10－5mol/L BPA和1×10－5mol/L BSA同时存在的溶液进行测定，考察扫速对二者作用完全峰电流的影响.结果表明，当扫速在0.10～0.40 V/s范围内变化时，峰电流均随扫速的增加而增加，与扫速的平方根成线性，线性方程为Ip=0.074 3+0.088 9 v1/2，r=0.991 6.说明此条件下电极反应过程主要受扩散控制［7］.

对于只有1.5×10－5mol/L BPA的体系，当扫速v在0.05～0.40 V/s之间，无论是峰电位Ep还是峰电流Ip都是与扫速的一次方成正比，氧化峰电流与扫速的关系式为Ip=23.27v+0.926，r=0.991，说明此时BPA在电极表面上的电极反应过程受吸附控制［7］.

2.6 静止时间的影响

对1.0×10－5mol/L BPA和1×10－5mol/L BSA同时存在的溶液进行测定，静止时间基本对电流没有影响，本实验的静止时间选择10 s.

2.7 双酚A与BSA相互作用的电化学行为

图4中的曲线为BPA与BSA在MWNT/GCE的循环伏安谱(CV).由图4可知，BPA在0.10 mol/L，pH=7.0的KH2PO4－Na2HPO4缓冲液中，有一个氧化峰，其电化学行为具有典型的不可逆特征，氧化峰电位(Ep)为0.56 V，随着1×10－5mol/L BSA加入，峰电位基本不变，峰电流减小.

2.8 反应的电子数与质子数求算

参照文献［8］可知不可逆波峰电位方程式为:

式中α为转移系数，D为扩散系数，KS为电极反应速率常数，F为法拉第常数，n为电子转移数.

又根据扫速与峰电位的关系

由式(2)、(3)可以得到:

根据不可逆吸附体系峰电流Ip与吸附电量Q关系式:

可测得电极反应的电子数n，式中Q=nFAΓ，为循环伏安单一过程的峰面积(以电量计)，F为法拉第常量，A为电极面积，Γ为吸附量，R为摩尔气体常量，T为热力学温度.由上可知，不必知道电极吸附量及电极面积的绝对值，只要测得某扫描速度下CV图上的面积Q即可求得n.

以不同浓度BPA测得的Ip、Q，由式(5)计算得:n=2，即在电极反应中有2个电子参与反应.又由(4)式得αn值为0.655，所以α =0.328.

又根据Nernst方程:

由上面n=2，计算得出转移的质子数m=2.03≈2，即参与反应的质子数为2.

2.9 BPA与BSA结合常数β和结合数m

对于BPA－BSA的复合物，可根据文献［9］算出两者之间的结合比和结合常数，假定BPA与BSA只形成一种简单的复合物BSA－mBPA，则结合反应如下:

式中β为结合常数.

氧化峰电流Ip与BPA浓度及ΔIp与BPA浓度的关系见图5.图中曲线a为没有加入BSA时BPA的氧化峰电流Ip随BPA浓度变化的关系曲线，曲线b为加入1.0×10－5mol/L BSA反应后，Ip随双酚A浓度变化的关系曲线，曲线c为曲线a和曲线b的氧化峰电流差值ΔIp(=Ip，a－ Ip，b) 随 BPA 浓度变化的关系曲线.

经推导可得下式:

式中，ΔIp，max为加入BSA前后氧化峰电流差值的最大值.

［1］STAPLES A C，DORN B P，KKECKA M G，et al.A review of the environmental fate，effects，and exposures of bisphenol A［J］.Chemosphere，1998，36(10):2 149 －2 173.

［2］KASHIWADA S，ISHIKAWA H，MIYAMOTO N，et al.Fish test for endocrine － disruption and estimation of water quality of Japanese rivers［J］.Water Research，2002，36(8):2 161 －2 166.

［3］KIM K B，SEO K W，KIM Y J，et al.Estrogenic effects of phenolic compounds on glucose－6 －phosphate dehydrogenase in MCF－7 cells and uterine glutathione peroxidase in rats［J］.Chemosphere，2003，50(9):1 167 －1 173.

［4］WANG P H.Environmental hormones and their harmful effects［J］.North Environment，2005，30(2):33 －36.

［5］熊何键，马英，汪琳，等.紫外辐射诱导牡蛎细胞DNA损伤的单细胞凝胶电泳检测［J］.云南民族大学学报:自然科学版，2010，19(6):400 －404.

［6］SUN Y Y，WU K B，HU S S.Voltammetric behaviors of diethylstilbestrol and its determination at multi－ wall carbon nanotubes modified glassy carbon electrode［J］.Acta Pharm Sinica，2003，38(5):364 －366.

［7］DONG S J，CHE G L，XIE Y W.Chemically Modified Electrodes［M］.Beijing:Science Press，2003:54.

［8］BARD A J，FAULKNER L R.Electrochemistry methods:fundamentals and applications［M］.NewYork:John Wiley＆Sons，1980:222.

［9］LABIRON E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionlesselectrochemical systems［J］.Journal of Electroanalyticak Chemistry，1979，101(1):19 －28.

(责任编辑王 琳)

Electrochemical Studies of the Interaction between Environmental Hormone Bisphenol A and Protein

WANG Chen，FU Yan-li，WANG Zhen，GAO Yun-tao
(Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry，State Ethnic Affairs Commission＆ Ministry of Education，School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650031，China)

The interaction between environmental hormone bisphenol A and bovine serum albumins was investigated by the means of electrochemical method.The results indicated that the oxidation peak currents of bisphenol A decreased when bovine serum albumins was added.Both proton and electron of electrochemical oxidation of bisphenol A at the electrode were 2.The combining ratio of bisphenol A to bovine serum albumins was 2∶1，with the combining constants of 5.81 ×1010.The proposed interactions is that BPA enters the hydrophobic water cavity of bovine serum albumins，causing the decrease of the dissociative concentration.

bisphenol A;bovine serum albumins;cyclic voltammetry;interaction

O 657.13

A

1672－8513(2011)02－0092－04

10.3969/j.issn.1672 －8513.2011.02.004

2010－12－02.

云南省社会发展科技计划项目(2007B148M);民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室开放基金(MJY090101).

王辰(1982－)，女，硕士研究生.主要研究方向:分析化学.

高云涛(1962－)，男，教授.主要研究方向:电分析化学.