过瘤胃保护烟酸的研制与稳定性研究

张立可 王 翀 王迪铭 朱海燕 刘建新 陈 强

烟酸是反刍动物机体内的一种必需维生素，是重要辅酶NAD和NADP的直接前体，参与脂肪酸、碳水化合物和氨基酸的合成和分解。一般认为，反刍动物瘤胃微生物可以合成足够量的烟酸来满足机体代谢和生产需要。但近来有报道，随着饲养条件及环境因素的变化，反刍动物需要补饲烟酸[1]。研究表明，烟酸对反刍动物的脂肪代谢[2]及酮病防治[3]、瘤胃发酵[4]、生产性能[5]等方面有改善作用。然而未包被烟酸在瘤胃中极不稳定，Santsch[6]报道指出，烟酸在十二指肠前消失率为98.5%。有研究表明，脂类表面被材是一种pH值敏感的物质，可在pH值接近中性的环境下不被降解，但在真胃内酸性条件下释放，故已有报道可用于小分子物质的过瘤胃保护被材，且保护效果较好[7]。

本文拟通过使用不同被材，不同的压力及烟酸含量生产得到过瘤胃保护烟酸产品。采用体外法评定包被烟酸的瘤胃消失率和瘤胃后释放情况，探索不同条件组合对过瘤胃包被烟酸保护效果的影响，并通过筛选获得高过瘤胃保护效果的烟酸产品，以期用于奶牛生产。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

以芯材（烟酸）含量、被材以及进料速度为变量，采用L9(34)正交设计法设计9种包被烟酸样品，具体设计见表1。

表1 L9(34)正交试验设计

1.2 包被烟酸的保护率测定

精确称取5 g包被烟酸于带塞锥形瓶中，加入100 ml水，加塞，放入37℃、50 r/min的水浴摇床中，分别于2、4、8、12 h取出，过滤得烟酸滤渣。

残渣（约0.04～0.3 g）经冷蒸馏水反复冲洗，无混浊后，采用复合预混料中烟酸、叶酸的高效液相色谱法（GB/T 17813—1999）测定其中的烟酸残余量。操作方法简要描述如下：将残渣置于10 ml棕色容量瓶中，加 1 ml碳酸钠溶液（0.1 mol/l），浸湿试样，加 7 ml提取剂混匀，于超声波水浴上震荡提取15 min，用提取剂定容至10 ml，混合均匀，3 000 r/min离心15 min，弃去上层凝固状油脂，与离心管中遮光4℃保存。测定时经0.45 μm滤膜过滤至带盖小瓶中，保证该试液的浓度≤5 μg/ml，4℃冷藏供高效液相色谱法测定烟酸浓度。

计算得到各包被烟酸的溶出率，并将不溶出率作为保护率。根据保护率结果，初筛得到4种保护烟酸，用于后续瘤胃消失率、瘤胃后释放率等测定，以得到最佳包被组合。

1.3 体外法瘤胃消失率测定

1.3.1 试验动物

浙江大学试验牧场饲养的3只体重相近、装有永久性瘤胃瘘管的湖羊，湖羊日粮为：混合精料180 g/d，苜蓿干草420 g/d。分早晚两次饲喂，自由饮水。

1.3.2 尼龙袋

取孔径为300目尼龙布，制成5 cm×5 cm的尼龙袋。尼龙袋采用涤纶线进行双道缝合，边缘用烙铁熨烫，使其无散边，密封。试验前将尼龙袋用蒸馏水洗净，65℃烘干，检查无破损方可使用。

1.3.3 制备缓冲液与瘤胃液

缓冲混合液的制备：缓冲混合液的pH值是7.1±0.15[8]。400 ml蒸馏水＋0.1 ml微量元素溶液＋200 ml缓冲液＋200 ml常量元素溶液＋1.0 ml刃天青溶液，用CO2气体饱和并升温至39℃后，加40 ml还原剂溶液，继续通入CO2，直至溶液由淡蓝色转变为无色。其中还原剂溶液(现用现配)：1 mol/l NaOH 溶液 2 ml、Na2S·7H2O 285mg、蒸馏水 47.5 ml；常量元素液(pH 值 6.8)：Na2HPO49.45 g、KH2PO46.20g、MgSO4·7H2O0.60g，加水至1000ml；缓冲液(pH 值 8.1)：NaHCO335.00 g、NH4HCO34.00 g。加水至1000ml；微量元素溶液：CaCl2·2H2O13.2g、MnCl2·4H2O 10.00 g、CoCl2·6H2O 1.00 g、FeCl2·6H2O 8.0 g，加水至100 ml；刃天青溶液：100 mg刃天青溶于100 ml蒸馏水。

上午08:00从3头瘘管羊的瘤胃瘘管中用真空泵抽取瘤胃液各200 ml，倒入保温锥形瓶中混匀，迅速搅拌用4层纱布过滤，将滤液加入到盛有缓冲液的烧瓶中。瘤胃液和缓冲液的混合液pH值为6.90±0.1，缓冲液与瘤胃液的比例为2：1。

1.3.4 体外模拟瘤胃消化

通过40目筛孔粉碎的玉米与羊草以1：1比例混合，每支玻璃注射器(Model Fortuna，Haberle Labortechnik，Lonsee-Ettlenscheiβ，Germany)中加入 200 mg(DM)该日粮。准确称取0.5 g四种过瘤胃烟酸初筛产品于尼龙袋中，并用橡皮筋扎紧袋口。共设置 2、4、6、8、12、24 h六个时间点，每个时间点3个重复。注射器于39℃的恒温水浴摇床上预热12 h，将30 ml的瘤胃液与缓冲液混合液抽入每个注射器，随机置于恒温（39℃）水浴摇床内培养。，设置好摇床频率。分别于2、4、6、8、12、24 h取出试样尼龙袋，倾去上清液，剩余物用冷蒸馏水冲洗至澄清，39℃烘干（48 h），取出烟酸残渣，测定烟酸残余量[预混料中烟酸的测定——HPLC法(GB/T 17813—1999)，同 1.2 节]。

1.4 体外法测定瘤胃后释放率

根据反刍动物消化生理特点，采用三级离体消化酶法评定[9]。

称取约0.75 g包被烟酸产品于尼龙袋中并装入玻璃瓶中，4种包被产品每种5个，共20个进行体外模拟瘤胃消化（同1.3.5）。16 h后取出所有尼龙袋，用冷蒸馏水冲洗至澄清，39℃烘干（48 h）。从每个袋子中准确称取3份80 mg烟酸残渣，放入10 ml试管中。加入2 ml含有1 g/l胃蛋白酶的0.1 mg/l盐酸中加塞培养1 h。接下来0.1 ml浓度为1 mg/l的NaOH溶液被加入体系中用以中和pH值，同时加入2.7 ml pH值为7.8的胰酶磷酸缓冲液，加塞，并将所有溶液在38℃下恒温培养。每种样品于加入NaOH溶液后0、4、8、12、24 h各取出3管（即3个重复），过滤并将剩余物冲洗干净，烘干后采用预混料中烟酸的测定——HPLC法[GB/T 17813—1999]（同1.2节）测定剩余物中烟酸含量，并计算得到烟酸瘤胃后释放率。

1.5 数据处理

采用Sharma等[10]报道的拟合公式,计算烟酸的有效降解率。

所有试验数据采用SAS 6.12中ANOVA进行方差分析，用Duncan's法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 包被烟酸的溶出率及保护率

包被烟酸的溶出率和保护率见表2、表3，统计分析结果见表4、表5。由表4可看出，当烟酸含量从45%下降到35%，包被烟酸8h保护率从73.5%上升到83.6%，但各组间差异不显著（P＞0.05）；当压力从11 kPa下降到7 kPa，烟酸8 h保护率分别为77.6%（11 kPa）、80.3%（9 kPa）、79.7%（7 kPa），但是各组之间差异不显著（P＞0.05）。从被材类型看，固体棕榈油脂（树脂1#）保护率达89.0%，而单硬脂酸甘油酯（树脂2#）被材保护率为72.4%，两种被材1：1混合作为被材时的保护率为76.2%，固体棕榈油脂（树脂1#）保护率显著优于其他组合（P＜0.05）。比较各组极差值大小，可见包被烟酸的被材对保护效果影响最大，因子主次顺序为包被材料＞烟酸含量＞压力（见表4、表5）。以单位质量下4、8、12 h包被烟酸的溶出率为标准，发现试验号为1、2、3、9的4种产品具有较高的保护率，用于后续试验。

表2 包被烟酸的溶出率

表3 包被烟酸的4 h和8 h保护率

表4 4 h与8 h保护率各因素效应分析

表5 8 h包被烟酸的保护率方差分析

2.2 包被烟酸的瘤胃降解率

未包被烟酸和包被烟酸产品的24 h瘤胃降解曲线见图1。未包被烟酸在2 h内100%消失，4种包被产品在模拟瘤胃内消化2 h后，除样品9外，其余3种样品降解率也都超过了70%。随时间的推移，烟酸降解率升高，24 h后1、2两个样品残渣内无法检验到烟酸，3、9两种样品的降解率分别为80.7%和90.6%，均显著低于未包被或1、2两个样品的消失率100%（P＜0.05）。

包被烟酸的有效降解率及其参数列于表6。设定当 k=0.03 时，有效降解率为样品 1=2＞9＞3（P＜0.05）；当 k=0.05 时，有效降解率为 1＞2＞9＞3（P＜0.05），即样品3的瘤胃有效降解率在4种样品中最低，保护效果最好。

表6 包被GABA的瘤胃降解参数与有效降解率

2.3 包被烟酸在瘤胃后的释放率

表7 包被烟酸的真胃释放率(%)

各包被烟酸的真胃释放率列于表7，经瘤胃降解后的残渣的瘤胃后释放率列于图2。包被烟酸在接受胃蛋白酶处理时并未有明显的释放，在胰酶处理下开始释放并随时间的推移不断增加。1、2两个样品的真胃释放情况较差，样品9的瘤胃保护效果优于样品1、2，但是未能在瘤胃后形成可有效释放，可能发生了过度保护。3号样品的释放率在各个时间点都高于其他样品，在24 h可达到包被纯烟酸的16.2%，说明其瘤胃后的释放率最佳。

综合上述分别测定的降解率和释放率，可以得到样品号为1、2、3和9的过瘤胃包被烟酸的总可利用率分别为3.31%、3.62%、16.2%、1.04%，以烟酸含量为35%，用固体棕榈油脂作被材，压力为7 kPa条件下生产的产品过瘤胃效果最佳。

3 讨论

近年来，应用于小分子物质的过瘤胃包被技术正在成为反刍动物营养研究的热点。其主要对象为氨基酸及其类似物[11]、维生素[12]及胆碱[13]、淀粉[14]和葡萄糖[5]。

本研究综合包被和微胶囊技术，采用载体膨化-成分吸附-外包膜的工艺流程生产过瘤胃保护烟酸，发现固体棕榈油脂的保护效率显著高于单硬脂酸甘油酯，该结果与采用相同工艺的过瘤胃γ-氨基丁酸（GBGA）[7]所报道的结果相一致。在瘤胃消失率、过瘤胃释放率等数据上，两者结果有较大差别。当k=0.05时，本试验最佳包被效果的3号产品（35%烟酸，单硬脂酸甘油酯，7 kPa）有效降解率也达到了67.5%，而其最佳包被的3号产品（50%GBGA，单硬脂酸甘油酯，11 kPa）有效降解率仅为15.9%。同样，其3号包被GBGA产品的总消化率达到了75.8%，而本试验中过瘤胃保护烟酸经16 h体外瘤胃消化后，24 h真胃模拟可利用率最高仅为16.2%。

造成上述差异的原因，可归纳为以下几种可能：①包被内容物本身的不同，本试验中2 h烟酸完全消失，但报道指出GBGA仍有部分剩余；②内容物含量不同，以及不同内容物与包被材料、压力之间的综合反应和链接的紧密程度；③体外法与体内法的差异，以及每个尼龙袋所含样品的质量差异(4 g包被GBGA vs.0.2 g过瘤胃保护烟酸)；④半体外法模拟真胃前，瘤胃消化的不同，本试验采用体外法，采用了16 h的体外模拟消化，而报道中则采用了24 h的体内瘤胃消化。

另外，张力莉等(2004)[9]报道，以乙基纤维素为壁材包被的过瘤胃保护性VA微胶囊在精粗比分别为20：80和55：45的日粮条件下24 h瘤胃中的降解率分别为9.94%和25.33%；在真胃中的释放率接近60%。但由于其包被材料及工艺流程与本试验相差较大，且被材也不一样，故结果可比性较差，但可提供一个改良包被水平的思路。

4 结论

用固体棕榈油脂被材或混合被材包被烟酸可在一定程度上免受瘤胃的降解作用，同时产品又能在瘤胃后有效释放。用固体棕榈油脂作为单一被材的保护效果优于混合被材。综合考虑瘤胃消失率和真胃释放情况，当烟酸含量为35%，用固体棕榈油脂作为被材，压力为7 kPa条件下生产的包被烟酸过瘤胃效果较好。

[1]Majee D N,Schwab E C,Bertics S J,et al.Lactation performance by dairy cows fed supplemental biotin and a B-Vitamin blend[J].J.Dairy Sci.,2003,86:2106-2112.

[2]Drackley J K D,W.Lacount,J.P.Ellott,et al.Supplemental fat and nicotinic acid for holstein cows during an entire lactation[J].J.Dairy Sci.,1998,81:201-214.

[3]刘桂林，王锦平，渠乐明,等.烟酸对奶牛酮血症的调节作用[J].中国畜牧杂志，1994，31(4):31-32.

[4]孙国君,等.不同水平烟酸对青贮饲料营养成分在瘤胃内降解率影响的研究[J].石河子大学学报(自然科学版),2000,4(1):

[5]李新建,高腾云,王永才.烟酸在反刍动物营养中的研究进展[J].安徽农学通报，2006,12(3):133-135.

[6]Santsch D E,J.Chiquette,R.Berthiaume,et al.Effects of the forage to concentrate ratio on B-vitamin concentrations in different ruminal fractions of dairy cows[J].Can.J.Anim.Sci.,2005,85:389-399.

[7]王迪铭,刘红云,王翀,等.过瘤胃保护性γ-氨基丁酸的调制与稳定性研究[J].动物营养学报,2010,22(5):1451-1456.

[8]Menke K H,Steingass H.Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[J].Anim.Res.Dev,1988,28:7-55.

[9]Sergio Calsamiglia and Marshall D.Stern A Three-Step In Vitro Procedure forEstimating IntestinalDigestion ofProtein in Ruminants[J].1995.J Anim Sci.,73:1459-1465.

[10]Sharma B K,Erdman R A.Effect of high a-mounts of dietary choline supplementation on duodenal choline flow and production responses of dairy cows[J].J.Dairy Sci.,1988b,71:2670-2676.

[11]Graulet B,Richard C,Robert J C.Methionine Availability in Plasma of Dairy Cows Supplemented with Methionine Hydroxy Analog Isopropyl Ester[J].J.Dairy Sci.,2005,88:3640-3649.

[12]张力莉,赵志恭,闫素梅,等.过瘤胃保护性维生素A微胶囊的制备及其效果评价的研究[D].内蒙古农业大学,2004.

[13]徐国忠,叶均安,陈伟健,等.保护氯化胆碱对奶牛泌乳初期生产性能和血浆生化指标的影响初探[J].中国畜牧杂志,2005,41(6):23-25.

[14]王艳青,陈喜斌.饲料淀粉的过瘤胃技术[J].中国畜牧兽医,2002,29(6)：54-55.

[15]刘骞,张洪友,李徐延,等.过瘤胃葡萄糖对泌乳早期奶牛血液生化指标的影响[J].黑龙江八一农垦大学学报,2009(6):39-42.