平喘方及其拆方对支气管哮喘小鼠肺组织转录因子T－bet/GATA－3表达的影响

白 莉 张新光 吴 杰 朱慧华 赵毅涛 张晓峰 虞坚尔

(1上海中医药大学附属市中医医院，上海市闸北区芷江中路274号，200071;2上海市中医药研究院中医儿科研究所;3上海中医药大学;4广东省中医院)

支气管哮喘是由多种细胞，包括炎性细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等)、气道结构细胞(气道平滑肌细胞和上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病［1］。近年来研究认为，辅助性T淋巴细胞两种亚型Th1/Th2的失衡是哮喘发病最重要的免疫学机制［2］。正常情况下，Thl和Th2细胞处于相对平衡状态，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能。当机体受到异常抗原刺激时，上述这种平衡被打破，Thl、Th2发生偏向，即可导致与Thl和Th2型反应相关的一些变应性疾病的发生、发展［3］。平喘方既针对哮喘发病之本——伏痰夙瘀，又降气平喘治标，是治疗哮喘的一剂良方。本实验通过动态观察平喘方对支气管哮喘模型小鼠Thl/Th2上游因子T－bet/GATA－3 mRNA表达的影响，研究其对支气管哮喘发病过程作用环节的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性BALB/c小鼠120只，4～6周龄，体重18～22g，由中科院上海实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 卵清白蛋白(Ovalbumins.OVA)购自上海伯奥生物科技有限公司;结晶氯化铝(AlCl3·6H2O)、氢氧化钠(NaOH)购自上海美兴化工有限公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)购自上海生物工程技术公司;DEPC处理水购自上海赛百盛基因公司;TRIZOLTM购自联合生物集团公司;GATA－3及T－bet单克隆抗体购自美国Santa cruz公司。氯仿HPLC级购自上海试剂一厂;异丙醇HPLC级购自苏州振亚化工厂;无水乙醇AR级购自上海振兴化工一厂;FQPCR试剂盒购自上海达为科生物科技有限公司。压缩喷雾治疗仪(Eurosol Aerosol Apparatus)，意大利梅法;旋涡振荡器(Vortex)XW－80A，上海青浦泸西仪器厂;干式恒温器(K10CD)，杭州蓝焰科技有限公司;－80℃低温冰箱，日本三洋;－20℃冷藏冰箱，伊来克斯BDC－280e);低温冷冻离心机(1 15K3K15)，Sigma(美国);生物安全柜(TYPE B2)，Sigma(美国);紫外杀毒车(ZXC型)，上海跃进医用光学器械厂;Real－time检测仪(7300Sequence Detection System)ABI－7500，ABI(美国)。

1.3 药物及制备方法 平喘方由炙麻黄、苦杏仁、炙紫苏子、莱菔子、大桃仁、淡黄芩等药组成。拆方1由炙麻黄、苦杏仁、大桃仁等组成;拆方2由炙麻黄、大桃仁等组成;拆方3由炙麻黄、炙紫苏子等组成。中药煎煮提取方法参考李仪奎［4］等的方法，第一次加13倍水旺火煮沸后，温火煮1h，保温2h，将药液滤出。第二次加入11倍水旺火煮沸后，温火煮1h，保温2h，将药液滤出。滤液合并浓缩，加入95%乙醇适量［依公式V 60/(95－60)计算］，冷藏静置24h。滤出将滤液浓缩至流浸膏样，配制至浓度为含生药量5.33g/mL。由上海市中医医院中心实验室制备。

2 方法

2.1 动物分组 将120只清洁级雄性BALB/c小鼠，随机分为6组:对照组、模型组、平喘方组、拆方1组、拆方2组、拆方3组。

2.2 造模方法 根据课题组成熟的动物模型［5］，采用OVA和Al(OH)3加入生理盐水腹腔注射致敏，造成支气管哮喘小鼠模型。将OVA溶于生理盐水配置10%浓度的致敏液，用前即时配置。除对照组外，每只小鼠分别于第1天和第14天以OVA、Al(OH)3和生理盐水配置成10%OVA生理盐水混合液1mL，腹腔注射致敏;第26天至第32天，每天将各组小鼠置于5L密闭容器中，以5%OVA生理盐水，由超声雾化器雾化吸入40min，激发哮喘，每d1次，共7d。对照组均以等量生理盐水进行腹腔注射和雾化吸入。

2.3 给药方法 各组均普通喂养。各组于致敏2周后开始用药，每日1次，共4周。将中药配制成5.33g浓度，平喘方组及拆方组以中药0.4mL/20g鼠(50g/kg·d)灌胃，对照组和模型组以等量纯水灌胃。

2.4 检测项目 各组分别于雾化激发哮喘后7d、21d，分两批处死、取样、检测，作动态观察。每时间节点每组分别取肺尖组织于冻存管，置于－80℃冰箱，采用RT－PCR检测小鼠肺组织T－bet、GATA－3 mRNA的表达;取左肺中叶，垂直于气道取材，制肺组织切片，10%甲醛固定，用光镜(HE染色)检测。

2.5 统计学方法 用SPSS17.0统计软件分析，数据以s表示，用One－Way Anova程序中Homogeneity－of－variance进行方差齐性检验，如方差齐则直接进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较;如方差不齐，用Transform程序中(Lg10+1)进行变量变换后，再用One－Way Anova程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较。

3 结果

3.1 一般结果 模型组小鼠经腹腔致敏后，即出现体重下降;经抗原激发后，出现烦躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁、毛发竖起、活动与饮食减少等症状，严重者口鼻轻度发绀;对照组呼吸平稳、皮毛光滑、活动敏捷、饮食正常、体重增加;平喘方及拆方1、2、3组小鼠毛色光泽，活动自如，饮食如常，体重增加。

3.2 小鼠肺组织T－bet、GATA－3 mRNA的表达如表1，哮喘激发7d后，与对照组比较:模型组T－bet明显降低(P＜0.05)，GATA－3明显升高(P＜0.05);T－bet/GATA－3比值明显降低(P＜0.05);拆方1、2、3组GATA－3升高(P＜0.01或P＜0.05);拆方1组T－bet/GATA－3比值降低(P＜0.05)。与模型组比较:拆方1、2、3组 T －bet升高(P ＜0.05);平喘方组和拆方2、3组GATA－3降低(P＜0.05);拆方3组T－bet/GATA－3比值升高(P＜0.05)。用药各组间比较，平喘方与拆方1、2、3组以及拆方各组之间T－bet无明显差异。拆方1组GATA－3较平喘方及拆方2、3组升高(P＜0.05或P＜0.01)。拆方3组T－bet/GATA－3比值较拆方1组升高(P＜0.05);平喘方组、拆方2组T－bet/GATA－3比值均与其他组无明显差异。如表2，哮喘激发21d后，与对照组比较:模型组T－bet明显降低(P＜0.01)，GATA－3明显升高(P＜0.01)，T－bet/GATA－3比值明显降低(P＜0.01)。平喘方组以及拆方1、2、3组T－bet降低(P＜0.01);平喘方组GATA－3略为降低(P＜0.05);拆方1、2、3组T－bet/GATA－3比值降低(P＜0.01或P＜0.05)。与模型组比较:平喘方及拆方1、2、3组T－bet升高(P＜0.01)，GATA－3降低(P＜0.01)，T－bet/GATA －3比值升高(P＜0.01)。用药各组间比较，拆方1组T－bet低于平喘方组、拆方3组(P＜0.05)，拆方2组低于拆方3组(P＜0.05);拆方1组GATA－3与平喘方组、拆方2、3组相比升高(P＜0.05);T－bet/GATA－3比值拆方1组低于其他各组(P＜0.05或P＜0.01)，而平喘方与拆方2、3组无显著差异。

表1 激发7d BALB/c小鼠转录因子T－bet与GATA－3的表达(s，n=10)

表1 激发7d BALB/c小鼠转录因子T－bet与GATA－3的表达(s，n=10)

注:与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P ＜0.01。

组别 T－bet(%)GATA－3(%)T－bet/GATA－3(%)5.50±3.25 0.36±0.15 18.07±13.18模型组 0.88±0.50＊＊ 3.13±1.79＊＊ 0.47±0.50＊＊平喘方组 2.14±1.12 0.59±0.35▲▲ 10.38±7.13拆方1组 1.80±0.66▲▲ 2.01±0.79＊＊ 1.09±0.66＊＊拆方2组 3.24±1.75▲▲ 0.90±0.32＊＊▲▲ 4.10±3.05拆方3组 2.41±1.15▲▲ 0.73±0.27＊＊▲▲ 3.71±2.18对照组▲▲

表2 激发21d BALB/c小鼠转录因子T－bet与GATA－3的表达(s，n=10)

表2 激发21d BALB/c小鼠转录因子T－bet与GATA－3的表达(s，n=10)

注:与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，△△P＜0.01。

组别 T－bet(%)GATA－3(%)T－bet/GATA－3(%)9.11±3.09 0.95±0.68 28.50±11.52模型组 1.01±0.66＊＊ 4.52±3.61＊＊ 0.48±0.42＊＊△△平喘方组 3.43±2.90＊＊△△ 0.55±0.39＊△△ 13.48±12.63△△拆方1组 1.77±0.54＊＊△△ 1.44±0.82＊＊△△ 1.06±0.60△△拆方2组 2.05±0.87＊＊△△ 0.71±0.50＊＊△△ 2.59±1.46△△拆方3组 3.40±1.62＊＊△△ 0.71±0.29＊△△ 5.23±2.90对照组△△

3.3 小鼠肺组织切片病理检测 对照组小鼠肺内细支气管上皮完整，管壁上皮、肌层及管周均为正常肺组织。哮喘激发7d后，模型组小鼠肺内细支气管壁黏膜上皮部分损伤脱落，管腔内见炎性渗出物充塞和脱落的黏膜上皮细胞，管壁及管周大量炎细胞浸润;平喘方组小鼠肺内细支气管未见明显改变，仅见管周炎细胞浸润;拆方1组仅见管周淋巴组织增生;拆方2组部分细支气管腔内少量炎性渗出物;拆方3组仅见管周淋巴组织增生。哮喘激发21d后，模型组小鼠细支气管大部分黏膜上皮细胞损伤脱落，管壁平滑肌部分破坏。管腔内炎性渗出物充塞，管壁及管周大量炎细胞浸润。平喘方组为正常细支气管、肺组织，管壁及管周炎细胞浸润;拆方1组仅见管周淋巴组织增生;拆方2组正常细支气管、肺组织，管周少量炎细胞浸润;拆方3组仅见管周少量淋巴组织增生。

4 讨论

Th1/Th2细胞平衡失调，机体正常的免疫耐受功能受损，是哮喘发病最重要的免疫学机制［6］。研究结果表明，转录因子的选择性表达是对Th细胞定向分化起关键作用的调控因素，其中T－bet和GATA－3分别控制原初性T细胞向Thl和Th2的定向分化［7］。转录因子T－bet/GATA－3失衡表达与气道炎症密切相关，能客观反应哮喘免疫失衡，很可能是哮喘气道炎症形成的重要原因之一［8］。多项研究表明，哮喘患儿T－bet mRNA表达水平与Thl百分率呈正相关，与Th2百分率呈负相关;而GATA－3 mRNA水平与Th2百分率呈正相关，与Thl百分率呈负相关;且T－bet/GATA－3 mRNA比值与Thl/Th2比值呈正相关［9］。通过对T－bet/GATA－3关键调控因子的研究，促使T－bet/GATA－3趋向平衡，能够早期阻止上皮下纤维化形成等早期气道结构改变，进一步改善气流受限，从而为靶向治疗哮喘提供新策略［10］。因此，我们通过哮喘动物模型观察转录因子T－bet/GATA－3表达的变化，探讨平喘方及其拆方对哮喘的防治作用，为中医药创新和推广提供实验资料。

哮喘属中医“哮证”“喘证”“咳嗽”等范畴。哮喘是内外因相互作用的结果，其发作内因责之“正气虚弱”“痰瘀伏肺”，外因多责之外邪、异气、饮食等多种因素。宿痰为哮喘发病之夙根，瘀血是哮喘迁延不愈的重要因素，痰瘀互结导致哮喘反复发作［11］。虞坚尔教授在三十余年的临床实践中，承前人之理，立化痰祛瘀平喘法，创平喘方，取得很好的效果。平喘方立足于哮喘发病之本——“伏痰”，标本兼治，宣肺降气以定其喘，化痰以针对其病本，病久必瘀，兼化瘀以撼其根，以达平喘之目的。平喘方以炙麻黄味辛、微苦，性温，为肺经要药，能宣肺平喘为君;以莱菔子、紫苏子、杏仁化痰，桃仁祛瘀为臣;佐以地龙干、椒目、黄芩，使以甘草。诸药相配，共奏化痰祛瘀、降气平喘之效［12］。拆方1祛痰化瘀;拆方2化瘀为主，寒热平调;拆方3祛痰为主，兼以宣肺降气，寒热平调。本研究发现，哮喘模型小鼠肺组织T－bet mRNA的表达明显降低，GATA－3 mRNA的表达明显升高，T－bet/GATA－3表达失衡。平喘方及拆方各组均能不同程度地调节支气管哮喘小鼠Th1/Th2上游因子T－bet/GATA－3 mRNA的表达，对Th1/Th2细胞的失衡有纠正作用。其中，对T－bet/GATA－3 mRNA的调节，激发7d拆方3组较好，对于Th1/Th2失衡具有双向纠偏的作用，与平喘方组接近。激发21d平喘方组较佳。

平喘方及拆方各组均能减轻气道黏膜上皮损伤，减少气道炎细胞浸润，减轻支气管壁及周围间质充血水肿，对减轻哮喘发病症状，降低气道高反应性，改善哮喘气道炎症有明显的作用，其中，拆方3组疗效疗效接近平喘方原方组，说明平喘方是可以精简的。对平喘方进行拆方研究，有助于阐明中药复方的配伍组成原理及作用机制，为指导临床用药提供实验依据。

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