利用家蚕BmNPV生物反应器规模化生产基因工程产品的关键技术研究

丁 农 张金卫 李江涛 鱼南洋 邹国平 冯世民 徐森华

(1湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000; 2长兴县农业局，浙江长兴 313100)

随着现代生物技术的发展，家蚕生物反应器(即家蚕－BmNPV表达系统)成为免疫学和基因工程真核生物表达系统等研究领域的重大进展之一［1］。家蚕生物反应器被认为是目前最有经济意义的个体表达系统，有基因工程产品“微型发酵罐”之称，在免疫学的研究和应用中成为制备新型基因工程疫苗的优选体系。在人以及动物的传染病中，已有乙肝、丙肝、禽马立克氏病、传染性法氏囊病及口蹄疫(FMDV)等多种病毒的相关保护性抗原基因，在家蚕－BmNPV表达系统中得到成功表达［2－8］，重组基因工程疫苗的研制成功，在医学和农业科研中发挥了重要的作用，展示出诱人的应用前景。

目前，应用家蚕生物反应器生产基因工程产品，主要是利用注射器对蚕蛹蛹体逐一进行人工接种，在操作过程中存在以下问题:一是蚕蛹蛹期短，很难进行规模化生产;二是用工量大、时间集中，劳动强度大、生产效率低;三是接种量很难控制，误差大，造成蛹体接种后反应不一致，既影响产品的质量，又增加后续工作量。本研究是在中国农业科学院生物技术研究所和中国农业科学院兰州兽医研究所研制口蹄疫基因工程疫苗的基础上，利用家蚕生物反应器进行口蹄疫疫苗抗原规模化生产关键技术的研究，为家蚕生物反应器进行规模化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

rBmNPV(P1－2A3C)重组病毒培养液，由中国农业科学院生物技术研究所提供;口蹄疫ELISA检测试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供;秋丰×白玉蚕品种，由湖州市农业科学研究院提供。

1.2 蚕蛹最佳冷藏时间试验

将秋丰×白玉饲养至上蔟7 d后采茧并冷藏于4～5℃中保存，每隔5 d取1批蚕茧(200粒)削茧后取出蚕蛹，按每颗蛹105pfu的剂量接种rBmNPV(P1－2A3C)重组病毒培养液，然后放置在25℃环境下表达4～5 d，收集发病蚕蛹血淋巴，于－20℃保存，共接种4批，以接种未经冷藏的蚕蛹作为对照。根据口蹄疫ELISA检测试剂盒操作步骤，检测口蹄疫抗原组合基因(P1－2A3C)在不同冷藏时间蚕蛹中的表达效率。具体操作步骤:96孔酶标板用兔抗FMDV阳性血清包被，4℃过夜;用脱脂奶粉封闭后，将所收集的蚕蛹血淋巴做2倍梯度稀释，37℃作用1 h;用PBS洗涤后加入豚鼠抗FMDV阳性血清，37℃作用1 h;用PBS洗涤后加入HRP－兔抗豚鼠IgG，37℃作用1 h;加入底物OPD－H2O2，于37℃作用15 min，用终止液结束反应，于492 nm处测定A值，即OD492nm值，该值越大表明表达的外源蛋白量越大。

1.3 目的蛋白在规模化生产中的表达时相的测定

将秋丰×白玉饲养至上蔟7 d后采茧、削茧，取100 kg蚕蛹接种rBmNPV(P1－2A3C)重组病毒培养液，接种后从48 h开始，每隔12 h收集发病蚕蛹，用口蹄疫ELISA检测试剂盒测定口蹄疫抗原组合基因(P1－2A3C)在蚕蛹中的表达时相。

1.4 蚕蛹集团注射机的研制及与手工注射的比较试验

在利用家蚕生物反应器生产基因工程产品的过程中，对蚕蛹蛹体的接种一般都是由人工逐一进行接种的，但是由于接种人员的熟练程度、疲劳程度等原因易导致接种量很难控制，人为误差较大，并且用工比较集中。为了解决这一问题，我们根据蚕蛹接种的一系列步骤(注射器消毒、清洗、加液、接种)与特点，试制了家蚕蚕蛹集团注射机。并检验了蚕蛹集团注射机的生产效率，方法是取100 kg蚕蛹接种rBmNPV(P1－2A3C)重组病毒培养液，用蚕蛹集团注射机和人工分别接种50 kg蚕蛹，从注射量精确度、注射速度、注射后蚕蛹的死亡率及目的蛋白的表达量进行比较。

2 结果与分析

2.1 蚕蛹最佳冷藏时间试验

利用口蹄疫ELISA检测试剂盒检测口蹄疫抗原组合基因(P1－2A3C)在不同冷藏时间蚕蛹中的表达效率，结果显示将蚕蛹冷藏于4℃后，5 d与10 d时的基因表达效率与未经冷藏处理蚕蛹的表达效率非常接近，能够满足规模化生产的需求;而15、20 d时的表达效率虽然也相近，但却远低于未经冷藏处理蚕蛹的表达效率，不能满足规模化生产的要求(表1)。从本次试验结果可知，将蚕蛹保藏于4℃10 d内接种不会影响目的蛋白在蚕蛹中的表达效率，在规模化生产中可以利用冷藏来延长蚕蛹的接种期限，加大产品的生产量。

表1 口蹄疫抗原组合基因(P1－2A3C)在不同冷藏时间蚕蛹中的表达效率(OD492 nm)

2.2 目的蛋白在规模化生产中的表达时相的测定

为了确定目的蛋白的最佳收集时间，对蚕蛹接种rBmNPV(P1－2A3C)重组病毒培养液后，从48 h开始，每隔12 h随机收集200头发病蚕蛹的血淋巴，于－20℃下保存。利用口蹄疫ELISA检测试剂盒检测血淋巴中目的蛋白的表达量，结果是在48 h时就检测到了目的蛋白的表达，且随着感染时间的延长而迅速增加，108 h后保持稳定状态。因此，在蚕蛹接种后108～120 h收集蚕蛹的血淋巴，均可获得很高的蛋白表达量。从而可知，蚕蛹在108 h时目的蛋白的表达量达到最高量并保持稳定状态(表2)。

表2 口蹄疫抗原组合基因(P1－2A3C)在蚕蛹中不同时间的表达效率

2.3 蚕蛹集团注射机的研制及与手工注射的比较试验

根据家蚕蚕蛹接种的一系列步骤特点，我们研制了家蚕蚕蛹集团注射机(图1)，该机器是一种半自动化的机械注射装置，具有高效、安全、注射量准确、结构简单及使用方便的特点。该机器已获国家发明和实用新型专利(专利号分别为:ZL 2009 1 0095597.1、ZL 2009 2 0113230.3)。

图1 蚕蛹集团注射机整体结构示意图

家蚕蚕蛹集团注射机研制成功后，我们进行了用蚕蛹集团注射机注射蚕蛹与手工注射蚕蛹的比较试验，从试验结果看(表3)，机器注射的工作效率是手工注射的4.26倍，注射后蚕蛹的死亡率、目的蛋白的表达量相近。值得注意的是，手工注射的速度与操作人员的熟练度、疲劳度等因素有关。由于机器注射和手工注射使用的是同一型号的注射器，故精确度是一样的，但在实际操作中，人工注射由于不同操作人员的熟练度不一样而导致注入蚕蛹的病毒量会出现误差，而机器注射则避免了这一误差。

表3 蚕蛹集团注射机注射蚕蛹与手工注射蚕蛹的效果比较

3 小结与讨论

家蚕饲养历史悠久，遗传背景清楚，利用家蚕生物反应器生产有用蛋白比其他表达系统更具优势。目前，已有多种蛋白得到了高效表达，部分蛋白生产已取得了转基因生物安全生产证书，可以进行大规模的面上生产。在家蚕生物反应器生产的目的蛋白中，多数是利用家蚕幼虫进行表达目的蛋白，虽然家蚕幼虫能获得高效的目的蛋白表达，但由于幼虫期比较活泼，逐一接种难度比较大，且收获目的蛋白时较为麻烦。我们研究发现利用家蚕蚕蛹进行目的蛋白表达可以获得同样的效果，并且更容易收获目的蛋白，这为规模化利用家蚕生物反应器生产有用蛋白奠定了基础。

本研究主要是在中国农业科学院生物技术研究所和中国农业科学院兰州兽医研究所研制的口蹄疫基因工程疫苗的基础上，研究利用蚕蛹进行规模化生产的关键技术，根据口蹄疫抗原组合基因(P1－2A3C)在不同冷藏时间的蚕蛹中的表达效率可知，通过低温(4℃)冷藏蚕蛹，可以延长10 d的生产时间，并且其蛋白的表达效率几乎不受影响，从而可以加大产品的生产量。值得注意的是，在应用蚕蛹进行生产其他基因工程产品时，随着表达的目的蛋白的不同，蚕蛹的冷藏时间会有所不同，实际生产中应根据表达不同的目的蛋白进行蚕蛹冷藏时间实验，确定所要生产蛋白的蚕蛹的最佳冷藏时间。

在生产中所表达的目的蛋白的收获时间是非常重要的，收获时间过早很难获得高效表达，收获时间过晚会影响蛋白的稳定性，从目的蛋白在规模化生产中的表达时相来看，在规模化生产中，蚕蛹接种后108～120 h收集蚕蛹的血淋巴，可获得最高的蛋白表达量。

在生产中需要对蚕蛹逐一接种，这在一定程度上阻碍了目的蛋白的生产，本研究中所发明的蚕蛹集团注射机很好地解决了这一问题，该机器使注射器的消毒、清洗、加药、蚕蛹接种在机械上逐一完成，明显提高了产品质量，工作效率是手工注射的4～5倍，注射后蚕蛹的死亡率和目的蛋白的表达量与手工注射相近，减轻了劳动强度，降低了生产成本，并且其结构简单、使用方便，便于利用蚕蛹作为生物反应器大规模生产基因工程产品。

［1］张耀洲，吴祥甫.家蚕生物反应器［M］.杭州:浙江大学出版社，2008.

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