神经病理性疼痛大鼠海马组织中NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表达及意义

张 丽，谭海波，孙 涛，傅志俭，于灵芝*

(1首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050;2山东大学附属济南市中心医院;3山东大学附属省立医院)

神经病理性疼痛是指由中枢或外周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征，通常在神经损伤正常愈合后仍持续存在。2009年10月～2010年6月，我们采用RT-PCR法测定了慢性坐骨神经挤压性损伤(CCI)大鼠海马组织中核因子-κB(NF-κB)mRNA、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和神经元型一氧化氮合酶(nNOS)mRNA表达，旨在进一步探讨神经病理性疼痛的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性 Wister大鼠70只，体质量220～280 g，由山东大学医学院实验动物中心提供。Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(Fermentas公司)，RT-PCR引物(上海生工生物工程公司合成)，von Frey丝(Stoelting公司，美国)，BME-410A热痛刺激仪(中国科学院生物医学工程公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备 将70只大鼠随机分为实验组及对照组各35只，实验组采用Bennett等［1］方法制备神经病理性疼痛模型:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，常规消毒右下肢，于股骨外侧纵行切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，接近分叉前游离出约7 mm神经，显微镜下4-0铬制肠线松扎4处，间隔为1 mm(以不影响神经外膜的血运为原则)。结扎时见肢体轻微抽动即模型制备成功，逐层缝合，术后肌注青霉素8万U，2次/d。对照组仅暴露坐骨神经干，不予结扎。

1.2.2 观察项目 ①机械痛阈、热痛阈:分别于术前1 d 及术后1、4、7、14、21、28 d 采用 von Frey丝以up-down法推算50%缩足反射阈值［2］，即机械痛阈值;BME-410A热痛刺激仪测定足底部热缩足反射潜伏期，即热痛阈值［3］。②海马组织NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表达:测定机械痛阈和热痛阈后于上述每个时间点处死大鼠5只，取海马组织，将标本迅速入液氮保存。Trizol一步法提取组织总RNA。紫外分光光度计测定浓度和纯度。取总RNA 2 μg用逆转录试剂盒合成cDNA，再行PCR扩增。RT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成，扩增条件为50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。95 ℃ 15 s，60℃ 1 min，95 ℃15 s，60℃ 15 s。反应在 Applied Biosystems 7500 PCR仪上进行。为了控制样本间mRNA质量的变异，同时检测管家基因 GAPDH表达。结果采用SDS软件进行2-ΔΔCT法相对定量分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，两样本均数比较采用成组设计的t检验，成组设计的多个样本均数的比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 机械痛阈及热痛阈值 见表1。

2.2 NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA 水平见表2。

3 讨论

表1 两组手术前后机械痛阈、热痛阈比较(n=5，)

表1 两组手术前后机械痛阈、热痛阈比较(n=5，)

注:与术前1 d相比，*P ＜0.05;与对照组相比，△P ＜0.05

组别 术前1 d 术后1 d 术后4 d 术后7 d 术后14 d 术后21 d 术后28 d实验组机械痛阈值(g) 28.6 ±3.2 16.9 ±2.3＊△ 14.1 ±1.9＊△ 10.6 ±2.5＊△ 12.6 ±2.2＊△ 15.6 ±2.1＊△ 17.6 ±2.6＊△热痛阈值(s) 16.5 ±2.0 8.8 ±1.6＊△ 5.9 ±1.0＊△ 6.4 ±1.3＊△ 6.8 ±2.1＊△ 8.9 ±1.5＊△ 9.7 ±1.9＊△对照组机械痛阈值(g) 27.3 ±2.6 28.2 ±3.1 26.6 ±3.5 26.0 ±3.3 25.8 ±2.7 26.1 ±2.3 27.4 ±3.1热痛阈值(s) 16.8 ±2.4 17.7 ±2.5 18.0 ±2.8 17.3 ±2.1 16.6 ±2.2 17.3 ±2.3 17.0 ±2.0

表2 两组手术后海马组织 NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表达(n=5，)

表2 两组手术后海马组织 NF-κB mRNA、iNOS mRNA、nNOS mRNA表达(n=5，)

注:与对照组同时点相比，*P ＜0.05;与同组术后14 d相比，△P ＜0.01;与同组术后28 d相比，#P ＜0.01

组别 术后1 d 术后4 d 术后7 d 术后14 d 术后21 d 术后28 d实验组NF-κB mRNA 1.050 ±0.578 1.640 ±0.064* 2.010 ±0.096＊△# 1.606 ±0.086* 1.529 ±0.064* 1.439 ±0.121*iNOS mRNA 1.166 ±0.133 1.500 ±0.176* 1.494 ±0.121* 1.583 ±0.132* 2.252 ±0.126＊△# 1.684 ±0.097*nNOS mRNA 1.153 ±0.137 1.098 ±0.109 1.308 ±0.121* 1.462 ±0.099* 1.995 ±0.117＊△# 1.502 ±0.108*对照组NF-κB mRNA 0.989 ±0.114 1.061 ±0.058 1.108 ±0.072 1.012 ±0.053 1.018 ±0.0562 1.004 ±0.134 iNOS mRNA 1.209 ±0.135 1.285 ±0.094 1.323 ±0.111 1.246 ±0.125 1.277 ±0.114 1.323 ±0.131 nNOS mRNA 1.003 ±0.079 1.057 ±0.129 1.078 ±0.084 1.045 ±0.111 1.049 ±0.128 1.022 ±0.118

神经病理性疼痛发病机制复杂，临床治疗效果欠佳。NF-κB是一种具有多向性转录激活功能的调节因子，可以调控编码多种疼痛相关因子(NOS、TNF-α、IL-1 等)的表达［4］，参与神经病理性疼痛的发生和维持。NF-κB对细胞内许多基因尤其涉及炎症和免疫反应的基因表达起着关键性的调控作用［5］。研究发现，NF-κB对于海马区的突触传导和维持长时程增强(LTP)、长时程抑制具有重要作用，且可能通过将神经突触传来的短时信号转换为基因表达的长时改变而参与对记忆形成、神经塑型以及慢性疼痛的调控［6］。本研究发现，与对照组及术前比较，实验组NF-κB mRNA水平于术后4 d开始增加，7 d达到高峰，术后14、28 d仍维持于较高水平。该结果表明外周神经损伤可以激活海马NF-κB，并且可以较长时间表达，从而参与对神经病理性疼痛的调控。

研究发现，NOS作为NO合成的限速酶参与了突触可塑及慢性疼痛等病理生理过程。NO既是细胞间和细胞内重要的信使分子，也作为一种神经递质参与神经病理性疼痛的调控［7］。由于NO是气体，且半衰期非常短，很难直接准确测定NO含量，因此，在研究中一般测定NOS，以此间接反映NO的生成速度和量。NO的调节是一个复杂而紧密的过程，其表达受NOS活性的影响，NOS的调节主要是在转录和转录后水平。文献报道，iNOS启动子上存在NF-κB的结合位点，可以使NF-κB活化，与DNA上的特异位点(κB位点)结合，从而调控NO的表达［8］。而NO在海马的学习记忆中有重要作用，其以一种逆向信息传递物质的形式参与海马的LTP效应，而后者则是学习记忆的神经基础和分子机制［9］。神经病理性疼痛大鼠可能正是通过海马NOS表达的增加，合成更多的NO参与LTP，从而进一步影响学习、记忆和认知能力。本文发现，与对照组及术前比较，实验组iNOS mRNA水平于术后4 d开始升高，nNOS mRNA水平于术后7 d开始升高，两者均于21 d达到高峰，在28 d仍维持在较高水平。提示nNOS和iNOS mRNA表达时间的延迟可能不参与慢性疼痛的触发和启动，而与慢性疼痛的长期维持有关。本研究我们还发现，与对照组及术前比较，实验组术后各时点术侧机械痛阈及热痛阈明显降低。

总之，CCI术后大鼠海马中 NF-κB及其下游nNOS、iNOS mRNA表达持续增加，可能与神经病理性疼痛的维持及其对认知能力的影响有关。

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