漳州地区战备消毒包内细菌来源的实验研究

张颖 王仙园 周娟

（1.武警北京总队医院，北京100027；2.第三军医大学护理学院，重庆400038）

战备消毒包是战时对伤员开展救治的医疗装备，通常灭菌后备用存放在战备仓库中。超过一定的储存时限，灭菌消毒包内就会培养出细菌。因此，了解消毒包内细菌来源，有利于采取针对性措施，从而确保和延长消毒包的有效储存时限。我们在沿海城市漳州某医院战备仓库对压力蒸汽灭菌战备消毒包的储存时限进行了动态观察，对消毒包首次培养细菌进行分类，鉴定为空气中的优势菌[1]。为进一步探究消毒包内细菌是否来源于空气中细菌，我们进行了实验研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

1.1.1 战备消毒包菌株来源 参照《消毒技术规范》对战备消毒包进行清洗、打包、压力蒸汽灭菌[2]，存放在战备仓库的储存箱内，于不同时限点进行取样培养，鉴定消毒包内首次培养的细菌为腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌。

1.1.2 战备仓库空气菌株来源 参照《消毒技术规范》“平板暴露法”进行[2]。根据细菌形态、革兰染色镜检、生化试验及VITEK系统对空气细菌进行鉴定，挑选出腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌菌株。

1.2 方法

1.2.1 转种、培养、振摇细菌 挑取上述细菌单个菌落，划线转种血平板，37℃ 培养24h；然后将细菌转种至3ml LB培养基中，放置于涡旋振荡器，固定，200r／min，37℃，振荡过夜。

1.2.2 提取基因组DNA 按照Omega基因组DNA提取试剂盒操作说明进行。

1.2.3 测定 DNA浓度 取 DNA溶液2μl，以198μl去离子水稀释，取100μl至比色杯中，调零后测定浓度。

1.2.4 ITS－PCR扩增

1.2.4.1 引物设计 检索 NCBI（http：／／WWW.ncbi.nlm.nih.gov／sites／entrez）得到腊样芽孢杆菌（GI：42779081）基因组全序列，在细菌的16SrRNA基因的2区及23SrRNA基因的10区序列内，应用分子生物学软件Primer Premier 5.0设计通用引物，P15’－TTGTACACACCGCCCGTC－3’、P2 5’－CCTTTCCCTCACGGTACTG－3’。

1.2.4.2 反应体系 反应总体系为50μl：5×Prime STAR Buffer（Mg2＋plus）10μl、dNTPMixture（各2.5mm）4μl、Prime 1（10μm）、Prime 2（10μm）、模板10pg～100ng各1μl、DNA polemerase（2.5U／μl）0.5μl、去离子水32.5μl。

1.2.4.3 反应条件 94 ℃预变性5min，28个循环（94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸70s），72℃延伸7min，4℃保温。

1.2.4.4 电泳 取PCR产物5μl，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，电压200V，时间25min。

1.2.4.5 扩增产物分析 将凝胶置于凝胶成像系统中进行扫描，对扩增产物利用Quantity One软件进行图像分析。

1.2.5 PCR产物回收 抽取腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌各2株（战备消毒包、空气各1株），共6株细菌，按照DNA凝胶回收试剂盒操作说明对PCR产物进行回收。

1.2.6 测序及同源性分析 将回收产物送公司进行P1、P2方向测序，将测得的基因序列用Blast（http：／／WWW.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）进行同源性分析。

2 结果

2.1 ITS－PCR扩增结果 腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌DNA ITS－PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳后，分别在850bp、1 000bp、1 100bp、1 000bp左右显现单一的特异性条带。扩增的结果与预计的碱基长度相吻合。

2.2 战备消毒包内细菌同源性分析 6株细菌ITS PCR回收产物测序峰主峰高、噪峰低，少见干扰峰。ITS序列相似性约为98%～99%（表1）。

表1 战备消毒包细菌与空气同种细菌不同菌株ITS序列相似性比对结果

3 讨论

不同细菌及同种细菌不同菌株之间的16Sr－RNA、23SrRNA之间的ITS序列存在着不同程度的差异[1]。这种差异以及处于16SrRNA和23Sr－RNA之间的位置特殊性，使其不仅可以用于菌种间的鉴别，还可以用来分辨非常接近的同种细菌内的不同菌株[2－4]。

本实验消毒包、储存环境空气的鉴定结果显示，二者具有密切关系。为此，我们采用ITS－PCR技术对消毒包、空气同种细菌不同菌株进行了分子水平的深入研究。

消毒包与空气细菌是否同源，必须通过它们基因序列的相似性来判定[5]，如果不同菌株之间的ITS序列相似性＞87%，且序列长度变异小于2%，就可以断定为序列同源，而且序列相似性越高，关系越密切[6]。

我们在16SrRNA及23SrRNA最保守的序列2区和10区设计一对通用引物，在同一反应条件下对战备消毒包与空气中腊样芽孢杆菌、人葡萄球菌、藤黄微球菌、沃氏葡萄球菌的不同菌株进行ITSPCR扩增，分别获得了大小约为850bp、1 000bp、1 100bp、1 000bp的单一特异性条带，ITS序列比对E值小，空缺少，序列相似性为98%～99%，说明消毒包与空气中的同种菌完全同源。提示战备消毒包存放于自然环境、暴露在空气中，超过一定储存时限，空气中细菌可以穿过消毒包外包装，对战备消毒包造成污染。

实际工作中，我们应考虑降低空气温湿度，减弱空气中细菌的渗透能力[7－8]，加强通风，提高空气的洁净度等措施来降低空气细菌污染战备消毒包的几率[9－10]，确保储存质量，减少短时间内反复消毒灭菌带来的人力、物力消耗，从而为战备物品管理提供新思路。

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