四川盆地部分地区土壤中苏云金芽胞杆菌分离与cry基因鉴定*

周长梅, 戴长春, 王晓云, 李 颖, 赵奎军

(东北农业大学农学院,哈尔滨 150030)

四川盆地部分地区土壤中苏云金芽胞杆菌分离与cry基因鉴定*

周长梅, 戴长春, 王晓云, 李 颖, 赵奎军**

(东北农业大学农学院,哈尔滨 150030)

[目的]对四川盆地土壤中Bt资源进行研究,了解其分布特点,为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。[方法]从四川盆地5个地区采集土样,分离苏云金芽胞杆菌野生菌株。利用PCR-RFLP及SDS-PAGE方法对Bt分离株进行基因型鉴定和蛋白分析,并对其室内杀虫活性进行初步测定。[结果]从207份土样中获得26株苏云金芽胞杆菌野生菌株,出菌率为12.56%。油镜观察可看到球形、方形、菱形及不规则形的伴胞晶体。在21株Bt分离株中检测到cry1、cry1I、cry2、cry9四类基因,且多数菌株都是同时含有多个基因类型,有 5株Bt分离株未发现已知基因;SDS-PAGE显示有9株菌株只表达了130 ku的蛋白,2株只表达了124 ku的蛋白,2株只表达了45 ku的蛋白,6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白,4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白,2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白,1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力测定结果表明:9株菌株对小菜蛾具有高毒力,2株对大猿叶虫有一定的杀虫活性。[结论]四川盆地土壤中Bt资源多样性丰富,其中有2株有一定的研究前景。

苏云金芽胞杆菌;cry基因; PCR-RFLP; 毒力测定

*致 谢: 在整个取样过程中得到代勇、周勤、张锦义、罗宏、李良忠等同学的大力支持和协助,在此深表感谢!

**通信作者 T el:0451-55191854;E-mail:kjzhao@163.com

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是自然界中分布十分广泛的革兰氏阳性细菌。该菌的显著特征是形成芽胞的同时会产生由cry或cyt基因编码的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein,ICPs),其对靶标昆虫具有强的毒杀活性,而对人及高等动物无害,因此,Bt成为目前世界上应用最为广泛的一种杀虫微生物,也是转基因抗虫育种中重要的基因资源。但随着Bt制剂及转cry基因作物在田间的大量应用,靶标昆虫的抗性风险也随之增强[1-2]。因此充分发掘我国丰富的Bt资源,筛选高毒力菌株和基因,对苏云金芽胞杆菌进一步的深入研究及开发利用具有十分重要的意义。

苏云金芽胞杆菌的分布极其广泛,在土壤、虫尸、贮藏物、植被以及污水、尘埃等基质上均有广泛的分布,而在土壤中分布最为丰富[3-4]。四川盆地有其独特的地貌及生态特点,地形复杂,植被多样且覆盖率高,使得微生态系统不易被破坏。因此对四川盆地土壤中Bt资源的研究既有利于了解该地区Bt资源的分布特点,同时也可为我国苏云金芽胞杆菌的储备奠定基础。作者从四川盆地5个地区采集207份土壤样品,从中分离出26株Bt野生菌株,并进行了基因型鉴定、蛋白分析及杀虫活性检测。

1 材料与方法

1.1 培养基

LB培养基:胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%。pH调至 7.0～7.2,固体培养基加入1.8%的琼脂粉。121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1/2 LB培养基:除琼脂粉及pH不变,其他成分减半。

1.2 土样的采集方法

土样采自雅安、重庆、内江、乐山、成都5个地区。先将表土层铲去1～2 cm,再取5～10 cm土层的土壤约50 g,采用五点取样法,每个采样点至少取5处,将采集的土样装入无菌牛皮纸袋内备用,并标明采集地点、植被、日期等。

1.3 菌株分离及筛选方法

采用醋酸钠选择性筛选法进行菌株分离[5]:称取1.0 g土样,放入盛有50 mL(含3.4%醋酸钠)的液体LB培养基中,30℃条件下,200 r/min振荡培养4 h;取土壤悬浮液10 mL,3 000 r/min离心15 min;取上清液1.5 mL于Eppendorf管中,75℃水浴15 min,取0.1 mL涂于LB培养基上,30℃倒置培养3 d。伴胞晶体的观察方法参见伯杰氏鉴定手册。

1.4 cry基因的PCR-RFLP初步分析

参照Kuo及宋福平等根据基因保守区设计的通 用引 物:K5un2/K3un2、K5un3/K3un3、S5uni/S3uni等共10对,鉴定Bt菌株的cry1/7/9、cry1I、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8和cry11类基因[6-7]。PCR反应参数:94℃1 min,52℃1 min,72℃2 min,共30个循环。PCR扩增产物的RFLP分析参照文献[6-7]。

1.5 Bt分离株杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析

将活化过夜的Bt菌画线于1/2 LB培养基上,30℃倒置培养48 h,刮取2 mg左右菌体于1 mL ddH2O中,12 000 r/min离心1 min,弃上清;加入NaCl(1 mol/L)400 μ L 悬 浮,12 000 r/min 离 心2 min,弃上清;加入 100 mL ddH2O悬浮,加入NaOH(0.5 mol/L)25 μ L 于室温放置 5 min,加入1/3体系的 3×Sample Buffer(T ris3.63 g,溴酚蓝0.3 g,SDS 6 g,甘油 30 mL,β-巯基乙醇 15 mL,调pH6.8定容至100 mL)65 μ L,100 ℃煮沸 10 min,12 000 r/min离心10 min,取上清-20℃保存备用。SDS-PAGE分析方法参见文献[8],以相对迁移率与已知蛋白分子量的半对数值绘制标准曲线测定蛋白的分子量。

1.6 胞晶混合物的制备

将苏云金芽胞杆菌在LB平板培养基上培养至胞晶分离,用含0.01%T riton-100的 1 mol/L的NaCl收集菌体,用无菌水洗涤3次后再重悬,将该胞晶混合物置于4℃冰箱备用。

1.7 室内杀虫活性检测

小菜蛾(Plutella xy lostellaL.)初孵幼虫,采自园艺实验站;大猿叶虫幼虫(Colaphellus bowringiiL.)由东北农业大学害虫生物防治实验室提供。将胞晶混合物用无菌水稀释成不同浓度。采用浸叶法进行饲喂,将甘蓝和小白菜叶片用清水洗净晾干,在稀释好的待测样品中浸泡10 min,晾干,放入生测瓶中,每瓶放入2～3龄幼虫20头,每个处理3次重复,饲喂2 d(大猿叶虫)和4 d(小菜蛾)后调查死、活虫数。计算其校正死亡率。以无菌水作空白对照,设3个重复。

2 结果与分析

2.1 Bt菌的分离及伴胞晶体形态的多样性

从四川盆地雅安、重庆、内江、乐山、成都5个地区采集的207份土样中,共分离出26株Bt野生菌株,出菌率为12.56%(表1)。从表1可以看出:Bt分布的丰度与生态环境有很大关系。采自雅安地区的山林土出菌率最高,为23.07%,其次为采自乐山的山林土及雅安的茶园土,出菌率分别为12.50%及11.76%;而农田土的出菌率均低于山林土,这可能由于山区植被茂密、表土腐殖质含量高,微生态系统不被破坏,导致山林土出菌率较高。

表1 Bt菌的分离结果

显微镜检测发现26株Bt分离株伴胞晶体的形态有球形、方形、菱形及不规则形,且多数菌株都同时含有多种形态的伴胞晶体,充分体现了四川盆地Bt菌株资源的多样性(图1)。其中只含有菱形晶体的菌株5株,同时含有菱形、方形、球形晶体的菌株13株,既含有方形又含有球形及不规则形晶体的菌株8株。

图1 在光学显微镜下(100×油镜)观察到的Bt菌株

2.2 Bt分离株的SDS-PAGE分析

对26株苏云金芽胞杆菌SDS-PAGE分析结果表明(表2、图2)。有9株菌株只表达了130 ku的蛋白,有2株只表达了124 ku的蛋白,有2株只表达了45 ku的蛋白,有6株同时表达了130 ku和60 ku的蛋白,有4株同时表达了124 ku和60 ku的蛋白,有2株同时表达了135 ku和60 ku的蛋白,有1株同时表达了130、90 ku及75 ku的蛋白。

图2 部分Bt分离株的SDS-PAGE分析

表2 Bt分离株的基因型、晶体蛋白及毒力检测结果

在目前已知的苏云金芽胞杆菌各种基因类型中,cry1和cry9类基因表达的蛋白分子量约为130 ku;而cry2类基因表达的蛋白在60 ku左右;cry1I类表达81 ku的蛋白,但SDS-PAGE分析的26株菌株中并未检测到81 ku的条带,有文献报道cry1I类基因通常是沉默的[9],本文的研究结果也印证了这一观点。

2.3 Bt分离株的cry基因鉴定

通过PCR-RFLP鉴定体系对分离到的26株Bt菌株进行了cry基因的鉴定。结果表明(表2、图3):有21株菌株含有cry1型基因,8株含有cry1I型基因,11株含有cry2型基因,13株含有cry9型基因;在已鉴定出基因型的21株菌株中,只有5株只含cry1类基因,其余16株菌株均是含有多种类型基因的组合,由表2可以看出cry1Aa、cry1Ac、cry1Ib、cry2Ba、cry9Ba基因型最丰富,同时含有cry1、cry1I、cry2、cry9类基因型的菌株最多为 6株,占已鉴定出基因型菌株的28.57%。另外5株菌株未鉴定出已知基因,有待于重新设计引物进行进一步的分析鉴定。

图3 部分Bt分离株的PCR-RFLP

2.4 Bt分离株的杀虫活性检测

对26株Bt菌株进行了小菜蛾及大猿叶虫的室内杀虫活性检测。结果表明(表2):有9株菌株对小菜蛾具有高毒力,4 d的校正死亡率达100%,却没有发现对大猿叶虫具有高毒力的菌株,只有菌株BF-5及CHD4对大猿叶虫表现出一定的活性,2 d的校正死亡率分别为42.9%及41.7%。

3 结论与讨论

从四川盆地5个地区的山林土及农田土采集的207份土样中,共分离出26株Bt野生菌株,平均出菌率为12.56%。伴胞晶体的形态有球形、方形、菱形及不规则形,且多数菌株都同时含有多种形态的伴胞晶体,充分体现了四川盆地Bt菌株资源多样性的特点。通常苏云金芽胞杆菌的资源分布受土壤类型、pH、土壤腐殖质含量、植被类型等生态环境影响[10-11]。本研究中采样点雅安地区的山林和峡谷植被保存完好,覆盖率高,表土中腐殖质含量高,采自该地区山林土的Bt出菌率最高为23.07%,且207份土样中,山林土的Bt出菌率均高于农田土的出菌率,也充分说明了Bt菌株的分布规律。

通过鉴定发现26株Bt菌中共含有cry1、cry1I、cry2、cry94种基因类型,且多数菌株同时含有多个基因类型。除普遍存在的cry1类基因外,cry9、cry2类基因也有较高频率,显示出四川盆地Bt菌株基因型较丰富的特点。

不同类型的cry基因编码的蛋白表现出不同的杀虫特异性。通常cry1、cry2、cry9基因编码的晶体蛋白对鳞翅目害虫具有毒杀活性[12],本研究中对小菜蛾具有高毒力的9株菌株均含有这几类基因的基因组合,由此可见含有多种基因类型的菌株通常具有较高的杀虫活性。自Tailor于1992年克隆的第1个cry1Ia1基因对鳞翅目和鞘翅目的害虫具有双重杀虫活性[13],此后又发现cry1Ia7对叶甲科马铃薯甲虫具有很高的杀虫活性[14]。本研究中得到的菌株BF-5及CHD4除对小菜蛾具有高活性外,对大猿叶虫也表现出较好的杀虫活性,校正死亡率分别为42.9%及41.7%,在这两个菌株中均未鉴定出cry3、cry8及cry1Ia等对鞘翅目具有杀虫活性的基因型,但SDS-PAGE分析表明这两个菌株分别表达了124 ku及135 ku较特殊的蛋白条带,说明在这两个菌株中可能含有新的基因或新的杀虫活性物质。这些研究结果将为今后苏云金芽胞杆菌的进一步开发利用奠定基础。

[1]Tabashnik B E,Van Rensburg J B,Carriere Y.Field-evolved insect resistance to Bt crops:definition,theory,and data[J].Econ Entomol,2009,102(6):2011-2025.

[2]Liu F,Xu Z,Zhu Y C.Evidence of field-evolved resistance to Cry1A c-expressing Bt cotton inHelicoverpa armigera(Lepidoptera:Noctuidae)in Northern China[J].Pest Manag Sci,2010,66(2):155-161.

[3]Ichimatsu T,Mizuki E,Nishimura K,et al.Occurrence ofBacillus thuringiensisin fresh waters of Japan[J].Curr Microbial,2000,40(4):217-220.

[4]Analia A,Eduardo G,Virla L,et al.Characterization of nativeBacillus thuringiensisstrains and selection of an isolate active againstSpodoptera f rugiperdaandPeridroma saucia[J].Biotechnol Lett,2009,31:1899-1903.

[5]杨自文,吴宏文,王开梅.从土壤中高效分离苏云金杆菌的方法[J].中国生物防治,2000,16(1):26-30.

[6]White-shang Kuo,Kin-Fu Chak.Identification of novelcrytype genes fromBacillus thuringiensisstrains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA[J].A ppl Environ Microbiol,1996,62:1369-1377.

[7]宋福平,张杰,戴莲韵,等.苏云金杆菌cry基因 PCR-RF LP鉴定体系的建立[J].中国农业科学,1998,31:13-18.

[8]萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,等译.第 2版.北京:科学出版社,1999:880-887.

[9]Choi S K,Shin B S,Kong E M,et al.Cloning of a newBacillus thuringiensis cry1I-type crystal protein gene[J].Curr Microbiol,2000,41(1):65-69.

[10]戴顺英,高梅影,李小刚,等.我国南北方土壤中苏云金芽胞杆菌的分布及杀虫特性[J].微生物学报,1996,36(4):295-302.

[11]张永安,宋福平,戴莲韵,等.我国不同森林立地带土壤中苏云金芽胞杆菌cry基因资源研究[J].林业科学研究,2003,16(1):19-25.

[12]Wang J,Boets A,Van R J,et al.Characterization ofcry1,cry2,andcry9genes inBacillus thuringiensisisolates from China[J].Invertebr Pathol,2003,82(1):63-71.

[13]T ailor R,Tippett J,Gibb G,et al.Identification and characterization of a novelBacillus thuringiensisdelta-endotoxin entomocidal to coleopteran and lepidopteran larvae[J].Mol Microbiol,1992,6(9):1211-1217.

[14]Escudero I R,Estela A,Porcar M,et al.M olecular and insecticidal characterization of a Cry1I protein toxic to insects of the families Noctuidae,Tortricidae,Plutellidae,and Chrysomelidae[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(7):4796-4804.

Isolation and cry gene identification of Bacillus thuringiensis from the soils in some regions of Sichuan Basin

Zhou Changmei, Dai Changchun, Wang Xiaoyun, Li Ying, Zhao Kuijun
(College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

[Objective]The resources ofBacillus thuringiensisin Sichuan Basin were studied to understand their distribution characteristics and prepared for their use in the future.[Method]Soil samples were collected from five regions of Sichuan Basin toscreen the Bt strains.The genotypes and insecticidal crystal protein(ICPs)of the strains isolated were identified by PCR-RFLP and SDS-PAGE,respectively.The toxicity of the Bt strains toPlutella xylostellaandColaphellus bowringiiwere evaluated in the lab.[Result]Twenty-six wild strains ofBacillus thuringiensiswere isolated from 207 soil samples,which accounted for 12.56%of the soil samples tested.Various shapes of parasporal crystals,includingspherical,square,bipyramidal and irregular,were observed in the strains.The genescry1,cry1I,cry2andcry9were found in 21 strains,and most of them contained more than one gene.However,no known genes were detected in the other five strains.Nine strains expressed the protein of 130 ku,and two strains expressed the protein of 124 ku,and two strains expressed the protein of 45 ku.But six strains expressed both 130 ku and 60 ku proteins,four strains expressed both 124 ku and 60 ku proteins,two strains expressed both 135 ku and 60 ku proteins,and one strain simultaneously expressed 130 ku,90 ku and 75 ku proteins.The bioassay results of the 26 strains indicated that nine of them were highly toxic toPlutellaxylostellaand two of the nine strains showed some toxicity toColaphellus bowringiilarvae.[Conclusion]There are rich Bt resources in Sichuan Basin,and 2 Bt stains isolated from there showed high prospective value.

book=21,ebook=394

Bacillus thuringiensis;crygene; PCR-RFLP; toxicity assay

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.004

2010-03-11

2010-05-25

国家公益性行业科研专项(200803032)