磁共振成像及对比剂在细胞移植中的研究进展

徐 波，梁碧玲，邓宇斌*

细胞移植(cell transplantation)是将自体细胞或异体细胞经体外扩增或分化培养后再移植入动物体特定部位的技术，主要应用于细胞治疗和科学研究中。随着干细胞研究的不断深入，移植干细胞通过分泌相关营养因子或定向分化更新病损组织的方式对特定疾病进行治疗已成为近几年的研究热点[1]。将细胞移植入体内后，研究者需要一种有效的手段监测移植细胞在迁移、分布、功能分化等，为评价治疗效果和研究作用机制提供依据。当细胞移植应用于临床治疗时，要求这种监测方法不能对患者造成二次损伤。磁共振成像技术 (magnetic resonance imaging,MRI)是利用人体组织中某种原子核的核磁共振现象，使用计算机辅助系统，将人体不同类型及不同生理状态的组织进行成像的诊断技术，具有无辐射损伤、非侵入性、高敏感性、高分辨率并能对监测对象三维重构等优点，非常适合用于活体监测移植细胞[2]。MRI对比剂(contrast agents)，可使局部磁共振信号发生明显变化。使用MRI对比剂对体外培养的细胞标记后进行细胞移植，可使用MRI对移植细胞实现连续多时间点监测。随着磁共振细胞标记及细胞成像研究的发展，大量的相关研究成果被陆续报道，本文就目前研究最活跃的细胞标记用磁共振对比剂和相应的标记方法作一综述。

对细胞进行磁共振对比剂标记，一方面对比剂的本身的特性决定了标记的效果，为了提高标记率，对比剂的分子量、电荷性及溶解性有严格限制。一般而言，分子量越小越则容易进入细胞质内。由于细胞膜表面带有微弱的负电荷，所以如果对比剂本身带有正电荷，则更容易吸附于细胞膜，有利于细胞标记。但如果对比剂表面带有负电荷则会受到细胞表面负电荷的排斥，可以利于多种阳离子转染试剂辅助进行标记。另一方面细胞自身的特性决定了标记难度，用于细胞移植的细胞主要有两类，即免疫细胞和干细胞。相比之下一部分免疫细胞具有较强的吞噬能力，可以直接通过胞吞或胞饮的方式将对比剂吞入胞内完成标记，而干细胞则较难进行标记，通常需要使用辅助方法进行有效标记。

1 细胞标记对比剂

1.1 顺磁性对比剂

这一类对比剂大多为镧系元素螯合物，其中以钆螯合物居多，包括Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA、Gd-HP-DO3A等。Gd-DTPA于1987年即被美国FDA批准为第一种用于临床诊断的磁共振对比剂。此类对比剂可在一定浓度范围内使标记细胞在T1加权成像时造呈高信号[3]。较早的研究工作，以研究对比剂性能为主，2004年Crich等[4]分别用Gd-HP-DO3A 和Eu-HP-DO3A标记内皮祖细胞，铕(Eu)为镧系元素，标记过程未使用其他辅助标记试剂。标记细胞中Gd浓度达到0.1 μmol/mg蛋白质。但将标记细胞移植入小鼠肾脏后，仅有Gd-HP-DO3A标记的细胞可以在MRI T1 WI呈高信号，信号增强效果可维持14天以上。同时发现标记后的内皮祖细胞具有良好的细胞活性，并保持有血管新生能力。研究者发现，某些细胞由于细胞类型的原因，很难使用顺磁性对比剂直接标记，需要通过辅助标记方法进行有效标记，2006年Terreno等[5]应用电穿孔法和直接孵育标记法分别将Gd-HP-DO3A标记入大鼠肝癌细胞的细胞质中和内囊泡中，发现等量的Gd-HP-DO3A进入细胞质比进入细胞内囊泡能在MRI下造成更强的信号变化。随着干细胞研究的发展，磁共振干细胞成像逐渐成为研究热点，2008年本课题组邓宇斌等，使用jet-PEI辅助Gd-DTPA成功标记骨髓间充质干细胞，通过细胞毒性测试等评价了标记过程的生物安全性，结果显示标记过程对细胞的生理状态没有明显影响，将标记细胞移植入大鼠脊髓损伤模型中，标记细胞在MRI T1WI呈高信号，可通过MRI对标记细胞进行示踪研究[6]。

1.2 超顺磁性对比剂

超顺磁性对比剂主要为一类氧化铁纳米颗粒，直径在20～150 nm之间。根据他们的粒径可将其分为小型超顺磁性氧化铁颗粒(SPIOs)和超小型超顺磁性氧化铁颗粒(USPIOs)[7]，通常粒径小于50 nm则被称为USPIOs。此类对比剂通过使组织的T2弛豫时间明显缩短，在T2WI上显示为低或无信号，在体内与周围组织形成对比成像，并且敏感性高于顺磁性对比剂，在更低的标记浓度下就可以造成足够的信号对比[8]。SPIOs自1996年即被美国FDA批准为第一种用于临床诊断的此类磁共振对比剂。由于SPIO和USPIO表面带有负电荷，与细胞膜表面负电荷具有一定的排斥作用，难以通过直接胞吞的形式进行细胞标记。通常使用带正电荷的转染试剂辅助进行细胞标记，可有效提高标记效果，并降低标记过程的细胞毒性[9-13]。王建东等构建铁蛋白高表达细胞株，并使用SPIO标记细胞，发现高表达铁蛋白可以提高标记效果，这可能是由于铁蛋白可促进细胞摄取和储存铁原子；细胞移植后体内MRI结果表明高表达铁蛋白可延长SPIO活体示踪细胞的时间，这可能是铁蛋白将细胞内降解的SPIO铁原子作为额外铁源进行摄取，从而增强磁共振信号[12]。目前，超顺磁对比剂干细胞标记已有大量研究，Gonzalez-Lara等于2010年了使用MPIOs标记间充质干细胞(MSCs)原位移植入大鼠脊髓损伤模型损伤位点，并对移植细胞完成了长达6周的MRI追踪，标记效果持续时间较理想[7]。本课题组也进行了类似实验，但发现由于很多损伤会造成机体局部出血和水肿，而出血和水肿会在T2 WI下呈低信号，超顺磁标记细胞在T2 WI下也呈低信号，两者具有明显的信号干扰，因此超顺磁性标记物在某些损伤出血动物模型的应用不佳[6]。

1.3 氟磁共振对比剂

氟对比剂主要应用于19F磁共振，由于19F磁共振不同于1H磁共振，其扫描成像的对象是氟原子而不是氢原子。由于动物内不存在内源性的氟，因此19F磁共振仅能对氟对比剂标记的细胞进行成像，特异性更强，但由于动物体其他组织在19F磁共振下没有信号，也就没有任何背景，所以无法定位，需要配合1H磁共振影像重叠进行定位[14]。2005年，Ahrens等使用全氟聚醚(PFPE)及转染试剂lipofectamine标记大鼠树突细胞，定量核磁共振分析表明单独使用PFPE进行标记组，标记细胞内PFPE浓度达到0.25 ng/cell。但随着细胞增殖，标记细胞内的PFPE随时间逐渐降低，体外培养5天后，胞内PFPE浓度减少85%。研究者将PFPE标记的细胞移植入大鼠体内，使用19F磁共振和1H磁共振分别成像后叠加图像，实现了对标记细胞的定位示踪并观察到移植细胞在体内迁移情况[15]。

2 标记方法分类

2.1 直接胞吞或胞饮的方式

胞吞或胞饮的方式主要用于标记免疫细胞，例如巨噬细胞、树突细胞等。这类细胞具有很强的吞噬能力，可以通过吞噬作用直接将对比剂颗粒吞入细胞质中，并不需要其他辅助标记方法。Rausch和Saleh 等分别使用USPIOs成功标记巨噬细胞，在脑梗大鼠模型中使用MRI监测到标记后的巨噬细胞[16,17]。de Vries等在人体上使用SPIOs标记树突细胞，在MRI下检测到标记细胞的迁移和分布，并证明了SPIOs标记的安全性[18]。另外Himmelreich等使用可被脂肪酶部分分解的可激活对比剂Gd-DTPA-FA标记树突前体细胞，标记完成后该对比剂处在失活状态，只有当树突细胞分化成熟并分泌脂肪酶后这种对比剂才能被激活进而引起磁共振信号变化，因此实现了通过磁共振监测细胞功能状态的目的。但是，Gd-DTPAFA颗粒较大，目前仅适合标记树突细胞[19]。

虽然干细胞普遍不具有吞噬能力，但也有研究证实可通过直接胞吞的方式对干细胞进行磁共振对比剂标记。Jendelová等用含有SPIOs的培养基孵育小鼠胚胎干细胞，并未采用其他辅助标记方法，普鲁士蓝染色和电子显微镜镜检证实SPIOs成功标记入干细胞，后移植入大鼠脑中，MRI检测到移植细胞的迁移和分布，标记效果可维持50天[20]。

内源性免疫细胞同样具有很强的吞噬能力，使得内源性免疫细胞可以吞噬组织间隙中的对比剂，这些组织间隙中的对比剂可以是通过静脉注射的对比剂，也可以是标记细胞移植入体内后随着分裂、死亡等生理过程释放到组织间隙中的对比剂。当内源性的免疫细胞吞噬这些对比剂后，可能在MRI上产生假阳性，使研究者无法正确分辨移植细胞和内源性免疫细胞[3,21]。

2.2 转染试剂辅助标记

许多干细胞无法通过用单独含对比剂的培养基简单孵育的方式进行标记。针对这点，目前许多研究者使用转染试剂辅助进行磁性标记，使用较多的转染试剂主要分为两类。一类为阳离子物质转染试剂，如多聚左旋赖氨酸(PLL) 、硫酸鱼精蛋白等；另一类为脂质体转染试剂。其工作原理都是依靠吸附作用使转染试剂与对比剂结合后，共同进入靶细胞内。阳离子物质转染试剂主要依靠刺激细胞膜促进胞吞，而脂质体转染试剂则主要依靠与胞膜融合将包裹的对比剂递送入细胞内。

SPIOs表面带有负电荷，无法有效吸附到细胞膜上，Arbab等使用鱼精蛋白在体外将SPIOs的标记入人骨髓间充质干细胞和CD34+造血干细胞中实现MRI监测，标记效果在CD34+造血干细胞中达到2.01±0.1 pg/细胞，在骨髓间充质干细胞中达到10.94±1.86 pg/细胞，并证实这种标记方法不会引起明显的细胞毒性，标记细胞的增殖和分化能力没有明显改变[22]。van den Bos等分别单独使用SPIOs或使用脂质体辅助SPIO对细胞进行标记，发现为了达到相同的有效标记浓度，不使用转染试剂标记组所需的SIPOs浓度是使用转染试剂标记组的100倍，且由于SPIOs浓度过高引起细胞内的自由基生成增加，对细胞产生明显毒副作用[23]。

2.3 受体介导的胞吞方式

采用受体介导的胞吞方式进行细胞标记，需要对对比剂进行局部修饰，针对目的细胞的特异受体，在对比剂上连接可与这些受体特异结合的基团，以达到提高转染效率的目的。目前主要选用的多为干细胞膜上的转铁蛋白受体，在对比剂上共价结合转铁蛋白后与细胞进行孵育进行转染。1998年，Moore等首次构建了含有转铁蛋白基团的氧化铁颗粒后，用这种特异对比剂标记干细胞，其转铁蛋白基团会和干细胞细胞膜上的转铁蛋白受体特异性结合，引起局部细胞膜内陷，进而形成内饮泡，将受体-转铁蛋白-氧化铁颗粒转运入细胞内，受体与转铁蛋白-氧化铁颗粒分离后，返回细胞膜，而将转铁蛋白-氧化铁颗粒则留在细胞内，可供MRI检测[24]。任静等构建前列腺干细胞抗原(PSCA)特异性MR分子探针7F5@GoldMag用于体外前列腺癌细胞MR成像，实现了对前列腺细胞的高效特异性标记，而对照组中使用7F5@GoldMag标记物对肝癌细胞无法进行有效标记[25]。

2.4 电穿孔等物理方法

电穿孔是功能强大转染技术，可将核酸、蛋白及其他分子导入多种细胞。通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术可以将核苷酸、DNA 与RNA、蛋白、糖类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。Geninatti等使用电穿孔方法将质粒DNA和Gd-DOTA-spd共同转入干细胞内，通过免疫组化和MRI共同证实了此方法对干细胞标记的有效性[26]。Walczak等使用130 V和17 ms的电脉冲条件将菲立磁颗粒转染入骨髓间充质干细胞和神经干细胞，并证实电穿孔标记法对干细胞分化能力没有明显影响[27]。Terreno等[5]，应用电穿孔方法将Gd-HPDO3A标记入大鼠肝癌细胞的细胞质中，并采用直接孵育法将Gd-HP-DO3A标记入大鼠肝癌细胞的内囊泡中，发现等量的Gd-HP-DO3A进入细胞质比进入细胞内囊泡能在MRI下造成更强的信号变化，其认为对比剂在细胞内分布的均匀程度影响MRI信号变化的幅度。

3 展望

MRI监测移植细胞要求细胞内对比剂浓度达到一定剂量，为了提高被标记细胞中磁共振对比剂的浓度，最简单的办法就是在标记的过程中增大对比剂的用量或者延长标记时间，但是这都将造成较强的细胞毒性，降低细胞的活力、增殖力以及分化能力，直接影响到细胞移植后的治疗效果。而且，某些情况下提高对比剂浓度并不一定能有效提高标记效果。较早的研究已经总结出了各类常用对比剂在不引起明显细胞毒性的范围内所能使用的最高剂量和最长标记时间。随后研究者将目光集中于开发新型对比剂和辅助标记方法，如辅助转染试剂、对比剂表面靶向修饰等，通过这些方法，研究者已经可以对多种较难标记的细胞实现在低毒甚至无毒的条件下完成标记。通过以上努力，研究者实现了通过MRI监测移植细胞的迁移与分布的目的。但随着移植细胞的凋亡、增殖或其他生理活动，细胞中的部分对比剂会释放到组织间隙或其他内源性细胞中引起假阳性，这一问题仍待解决。事实上，目前更多的研究集中于监测移植细胞在体内功能状态的变化，本文作者所在课题组现在也在进行此类研究。此类研究主要以两种策略为主，既基因表达报告标记物策略和酶解激活报告标记物策略。细胞功能状态的改变实际上是由某些特定基因表达的变化引起的，针对这些基因及其下游表达产物设计可调控对比剂，就可以实现依靠特定基因的表达控制对比剂的活性，只有特定基因表达后对比剂才被激活，才能引起MRI信号变化，从而实现通过MRI监测细胞功能状态的目的。本课题组正在进行新型基因表达报告标记物的研究工作，预期通过MRI监测移植干细胞在体内定向分化的过程。

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