儿童肺炎链球菌血清型分布及其对抗菌药物的耐药性

张 泓， 李万华，孔 菁， 王 春，陆 敏，陆 权

肺炎链球菌(S.pneumoniae)是儿童社区获得性感染的主要病原菌，可引起肺炎、脑膜炎、菌血症、中耳炎、鼻窦炎等疾病，发病率和病死率高。20余年来，青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)感染，给治疗带来困难，已成为全球关注的严重问题。肺炎链球菌疫苗是预防儿童呼吸道感染的重要手段，也是预防耐药菌扩散的措施之一。本研究检测2007年10月—2008年5月我院呼吸科患儿鼻咽分泌物分离肺炎链球菌的血清型分布及不同血清型菌株对抗菌药物的耐药状况，为控制耐药传播和疫苗免疫预防的可行性提供理论依据。

材料与方法

一、材料

(一)菌株来源 菌株分离自2007年10月—2008年5月我院呼吸科患儿鼻咽分泌物分离的肺炎链球菌338株，其中分离自2岁以下婴幼儿192株，分离自2～5岁儿童146株。

(二)多价血清和培养基 多价血清为丹麦血清研究所(Statens Serum Institut，Denmark)商品。药敏试验用MH培养基为英国OXOID公司商品。

(三)抗菌药物 抗菌药物E试验纸片为法国生物梅里埃公司商品。抗菌药物品种见结果部分。

二、方法

(一)血清分型 采用荚膜肿胀试验进行血清分型。操作步骤按照文献［1］进行。购买的血清能明确判定 23 价多糖疫苗覆盖的血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、l8C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F)和 6A，此外的血清型在本研究中不能分型。根据血清型分布，计算多价疫苗 PCV7(4、6B、9V、14、18C、19F 和 23F)，PCV11(在 PCV7 基础上增加 1、3、5、7)、PCV13(在 PCV11基础上增加6A、19A)包含血清型的所占比率，即疫苗覆盖率。

(二)药敏试验 采用E试验法检测8种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)，包括青霉素、阿莫西林-克拉维酸、头孢克洛、头孢呋辛、头孢曲松、红霉素、阿奇霉素和莫西沙星。操作按照药敏试验纸片生产厂家法国生物梅里埃公司产品说明进行。结果判断依据为CLSI 2009年标准。每批药敏试验检测均纳入质控菌株肺炎链球菌ATCC 49619。

(三)统计学方法 采用WHONET 5软件进行数据分析。有关率的比较采用卡方检验，P＜0.05提示差异有统计学意义。

结 果

一、肺炎链球菌血清型/群的分布

338株肺炎链球菌主要血清型依次为19F 138株(41.0%)、19A 67 株 (19.8%)、14 型 30 株(8.9%)、23F 14 株(4.1%)、6B 13 株(3.8%)、6A 12株(3.6%)和 15B 10 株(3.0%)。另有 3.8%(13/338)的菌株属于其他血清型。12.0%(41/338)的菌株不能为所采用的方法明确分型。PVC7的覆盖率58.9%，PVC13的覆盖率84.3%。在青霉素不敏感肺炎链球菌(PNSP)和红霉素耐药肺炎链球菌(ERSP)中PCV7的覆盖率分别为41.9%(26/62)和 59.6%(198/332)，PCV13 的覆盖率分别为72.6%(45/62)和 84.9%(282/332)。2 岁以下婴幼儿未分能型株为15.6%(30/192)，显著高于2～5岁儿童7.5%(11/146)的比率(P ＜0.05)，其他血清型分布差异无统计学意义。肺炎链球菌的血清型分布见表1。

表1 肺炎链球菌的血清型分布［n(%)］Table 1.Distribution of serotypes of S.pneumoniae［n(%)］

二、肺炎链球菌对抗菌药物的敏感性

338株肺炎链球菌中的PNSP(MIC＞2 mg/L)占 18.3%(62/338)，其中 40.3%(25/62)的菌株为PRSP(MIC ＞8 mg/L)，59.7%(37/62)的菌株为青霉素中介肺炎链球菌(PISP)。对阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松、头孢克洛和头孢呋辛的不敏感率依次为 36.2%、26%、92.6%和89.1%，对非 β 内酰胺类抗菌药物红霉素、阿奇霉素的不敏感率达98%以上，未发现对莫西沙星耐药的菌株。统计学分析表明19F和19A血清型的PNSP菌株对阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松的耐药率显著高于PSSP菌株(P＜0.01)。未能分型的PNSP对阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松以及头孢呋辛的耐药率显著高于PSSP(P＜0.01)。主要血清型的PNSP和PSSP菌株对8种抗菌药物的药敏试验结果见表2。

表2 不同血清型肺炎链球菌对抗菌药物的不敏感率(NS，%)Table 2.Nonsusceptible rate of Streptococcus pneumoniae to antibiotics by serotype(NS，%)

讨 论

肺炎链球菌疫苗是预防其感染的重要手段，也是预防耐药性扩散的措施之一［2］。适当的疫苗可预防90%以上的肺炎链球菌的侵袭性疾病，34%的中耳炎和11%～73%的肺炎，并可降低儿童鼻咽部肺炎链球菌的携带［3］。研究表明与疾病相关的血清型随时间、地点、年龄不同而变化，Ho等［4］的研究提示香港地区肺炎链球菌主要的血清型为6B、19F、23F和14型，其PCV7的覆盖率为66.5%，血清型种类在小于2岁和2～5岁儿童之间无任何差异。本研究分离到的血清型种类有13种，主要的血清型为19F、19A、14、23F、6B、6A、15B。PCV7 的覆盖率58.9%，显著低于本世纪初。赵根明等［5］研究提示PCV7覆盖率在上海儿童人群中可高达81%。在本研究中PNSP的判断标准采用CLSI 2008年版的新规，其所占的比率较2007年的90%有大幅度下降，仅为18.3%，其血清型种类主要为19F、19A和未能分型3种，占88.7%，与姚开虎等［6］报道的PNSP的血清型以 19、23、6、14 和不能分型为主、Richter等［7］报道美国的 PNSP 菌株血清型以 23、19、14、6和9为主更为集中，PCV7的覆盖率41.9%，显著低于对PSSP的覆盖率(62.3%)。本组资料显示19F和19A血清型的PNSP菌株对阿莫西林-克拉维酸、头孢曲松的耐药率显著高于PSSP菌株(P＜0.01)。

本研究中，PCV7未覆盖的19A型已达19.8%，成为第2位常见血清型。19A型菌株对β内酰胺类和大环内酯类抗生素表现出具有很高的耐药性。Farrell等［8］报道2000—2004年在14岁以下儿童临床分离株中，19A型所占比率由 4.7%升高到18.9%。Messina等［9］报道2002—2005 年在 5岁以下儿童侵袭性感染肺炎链球菌菌株中，19A型所占比率逐渐升高，分别为11.5%、16%、36%和44%。欧美国家使用PCV7后增加的19A型菌株的耐药性也在增强［8-9］，提示19A型菌株的增多可能不只是推广应用PCV7的结果，也可能与某些抗菌药物的选择性压力有关。

PCV13是在 PCV7的基础上增加了1、3、5、6A、7F和19A型，覆盖了具有较强耐药性的19A型。本研究中PCV13在338株肺炎链球菌中覆盖率达84.3%，在62株PNSP中覆盖率为72.6%。在332株ERSP中覆盖率为84.9%，应用该疫苗应可有效地预防儿童肺炎链球菌的感染和控制耐药菌株传播。

值得注意的是不能分型的菌株在本研究中占有相当的比率，在2岁以下婴幼儿和PRSP菌株中，分别占15.6%(30/192)和 64.0%(16/25)，而且这些菌株对常用抗菌药物表现出很高的耐药性。不能分型的菌株是否同属于某一或某几个血清型，以及它们在细菌耐药性传播中所起的作用有待于进一步研究。

在广泛使用疫苗后，欧美的监测研究表明，疫苗未覆盖血清型菌株的感染发病率有持续上升趋势，包括15A、23A、35B 以及不能分型的菌株［10］，这些菌株对常用抗生素具有较高的耐药性，尤其是不能分型菌株。因此，我们在应用疫苗预防肺炎链球菌疾病的同时，应加强耐药性监测，指导临床合理使用抗生素，以减少抗生素选择性压力下疫苗未覆盖血清型肺炎链球菌耐药株的传播流行。

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