高强度聚焦超声结合微泡造影剂杀伤原头蚴的效果*

孔 璟,叶 彬,2,张 静,韩秀敏,杨永海,李发琪

2.重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆400016;

3.青海省地方病防治研究所,青海 811602;

4.重庆医科大学医学超声工程研究所,重庆 400016

高强度聚焦超声结合微泡造影剂杀伤原头蚴的效果*

孔 璟1,叶 彬1,2,张 静1,韩秀敏3,杨永海3,李发琪4

目的探讨高强度聚焦超声结合不同比例微泡造影剂对离体原头蚴的杀伤效应。方法在原头蚴悬液中加入不同比例的微泡造影剂(含氟脂质体微泡),以相同超声功率及辐照时间作用(治疗声功率为50W,辐照时间为30s)。台盼蓝排斥试验计数原头蚴杀伤率,光镜检测原头蚴形态结构变化。结果超声剂量一定时,加入适宜比例的微泡造影剂组原头蚴杀伤率比单纯超声辐照组高(P＜0.05);随着微泡造影剂比例的增大,原头蚴杀伤率呈增高趋势;原头蚴结构损伤严重,台盼蓝染色深,被膜皱缩体积变小,甚至被膜崩解成碎片,小钩及钙颗粒散在分布。结论 HIFU结合微泡造影剂能增强对离体原头蚴的杀伤效应。

高强度聚焦超声波;微泡造影剂;棘球蚴;原头蚴

2.重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆400016;

3.青海省地方病防治研究所,青海 811602;

4.重庆医科大学医学超声工程研究所,重庆 400016

细粒棘球蚴是细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的中绦期幼虫,可寄生于人和多种食草家畜及其它动物,引起严重的人兽共患寄生虫病,称为囊性棘球蚴病(cyst echinococcosis),也称包虫病(hydatid disease)。该病呈世界性分布,在我国西部广大畜牧业地区发病率较高,严重影响人畜健康和经济发展[1]。棘球蚴内含数量不等的原头蚴(protoscolex),每一个原头蚴在终末宿主体内都能发育成一条成虫,在中间宿主体内能发育成新的棘球蚴,加重对机体组织的破坏。因此,原头蚴在细粒棘球绦虫的整个生活循环过程中具有重要作用。杀灭原头蚴,能中断棘球蚴生活史,达到治疗包虫病的目的。

高强度聚焦超声波(high intensity focused ultrasound,HIFU)是一种新型的微创甚至无创性治疗技术,近年来,HIFU已广泛应用于临床实质性器官占位性肿瘤的治疗[2]。本课题组研究证实HIFU杀伤棘球蚴具有肯定的效果,但使用一定范围的超声剂量并未将棘球蚴包囊内原头节全部杀灭,HIFU治疗效果尚有欠缺[3]。超声造影剂(ultrasound contrast agent,UCA)是一种临床用诊断试剂,内含微泡,也叫微泡造影剂(microbubble contrast agent,MBCA),在超声作用下会被破坏。早期研究已经证实微泡破坏能降低超声空化阈值,增强超声对靶组织的生物学效应[4]。本实验用 HIFU结合微泡造影剂杀伤原头蚴,观察不同浓度微泡造影剂经超声作用后对原头蚴的杀伤效应,并初步探讨超声结合微泡造影剂杀伤棘球蚴的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要仪器 JC-200型高强度聚焦超声肿瘤治疗系统由重庆医科大学超声工程研究所研发、提供。该系统主要包括超声换能器、治疗探头、B超监控系统、机械运动控制系统、治疗床等部分。超声换能器能将电能转换为声能,通过凹透镜聚焦原理,形成高能量聚焦点。系统参数设计如下:探头直径:150 mm,聚焦焦距为110 mm。额定输出声功率:250 W,连续可调。超声换能器的工作频率为1 000 MHz,实验中均采用连续波。超声换能器及治疗探头安装于盛循环脱气水的水囊底部,通过操作机械运动控制系统,能使换能器及治疗探头延X、Y、Z三个运动轴运动。超净工作台(上海博讯医疗设备公司)、其它仪器设备均由重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心及基础医学研究所提供。

1.1.2 主要试剂 微泡造影剂由重庆医科大学附属第二医院超声影像学研究所提供(自制含氟脂质体微泡,经第三军医大学钴源辐照中心辐照消毒处理);0.01mol/L PBS溶液(武汉博士德公司);0.25%台盼蓝染液(台盼蓝为美国Gibco公司产品,以PBS溶液稀释、过滤,终浓度为 0.25%);灭菌注射用生理盐水及其它试剂均为国产。

1.1.3 棘球蚴标本 棘球蚴感染羊肝采自青海省西宁市某屠宰厂。

1.2 方法

1.2.1 原头蚴悬液的制备 洗净羊肝表面血迹,75%酒精擦消毒后置于超净工作台内,按无菌原则穿刺包囊,抽取原头蚴和囊液收集于离心管中。待原头蚴自然沉积后,小心吸取管底原头蚴移入另一离心管中。肉眼见活原头蚴呈细小白色沙粒状,光镜下见大多数活原头蚴顶突和吸盘内陷,呈椭圆形,通体透亮,内部结构清晰完整,钙颗粒清亮。0.25%台盼蓝染色,检查原头蚴活力。若拒染的活原头蚴数量超过95%,即可用于实验。将原头蚴和囊液混匀成悬液,计数,调整原头蚴密度约为4 000～5 000个/mL,分装于无菌聚乙烯试管中,每管2 mL。

1.2.2 微泡造影剂的处理 将5 mL注射用生理盐水注入微泡造影剂内,震摇20 s,使之充分溶解。溶解后的微泡混悬液呈米白色,微泡浓度约为1×109个/mL,微泡直径 3.5～ 4.5 μ m,分布均匀。

1.2.3 实验分组 将上述制备好的原头蚴悬液分为4组。空白对照组:无任何干预措施;单纯MBCA组:加入与原头蚴悬液呈一定比例的造影剂悬液;单纯HIFU组:给予高强度聚焦超声进行辐照;HIFU结合MBCA组:加入与原头蚴悬液呈不同比例的造影剂悬液。以上各组中每根试验管设3个平行管,试验隔天重复1次,共重复5次。

根据前期试验结果,选择致50%原头蚴即刻死亡的HIFU剂量50W×30s作为本次试验所用剂量,即治疗超声功率为50W,辐照时间为30s。试验时,将装有原头节悬液的试管固定于治疗探头焦域内,管中液面没入脱气水液面下。声波由治疗探头从脱气水下向上发出,调整治疗探头位置,使焦点对准试管内悬液中心进行照射。

1.2.4 初步探索微泡造影剂与原头蚴悬液的比例按照1.2.3中所述的分组进行实验。单纯MBCA组:加入的MBCA悬液与原头蚴悬液之比为1∶2;HIFU联合MBCA组:下设5个组,加入的MBCA悬液与原头蚴悬液的比例依次为:1∶1000、1∶500、1∶100、1∶10、1∶2。

1.2.5 再次探讨微泡造影剂与原头蚴悬液的比例为了更进一步明确造影剂用量,再次进行前述试验。单纯MBCA组:加入的MBCA悬液与原头蚴悬液之比为1∶10;HIFU联合UCA组:下设6个组,加入的MBCA悬液与原头蚴悬液的比例依次为 :1∶100、1∶80、1∶60、1∶40、1∶20、1∶10。

1.2.6 台盼蓝排斥试验 照射后即刻将悬液轻轻混匀,取1滴原头蚴悬液涂片,滴入1滴0.25%台盼蓝,混匀。染色2 min,低倍镜下观察原头蚴形态及活力,计数。活原头蚴拒染呈透明状,偶见少数活力较强者收缩蠕动;死原头蚴不能排斥染料而被染成蓝色。每张玻片随机计数200个原头蚴,每根试管涂片3张,共600个原头蚴,计数其中活原头蚴数目。取每组中各平行试管中活原头蚴计数值的平均值作为该组活原头蚴的最终计数值,根据下面公式计算原头蚴急性杀伤率:杀伤率=(1-实验组活原头蚴数/对照组活原头蚴数)×100%。

1.3 统计学分析 所有数据均采用SPSS17.0进行统计学分析。实验数据以(±s)表示,组间比较采用卡方检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 对原头蚴的急性杀伤率 加入与原头蚴悬液成不同比例的MBCA悬液对原头蚴的急性杀伤率如表1、表2。试验中观察到:单纯MBCA组对原头蚴无明显杀伤效应,杀伤率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。单纯HIFU进行辐照时,对原头蚴有一定的杀伤效应,杀伤率在50%左右,与对照组相比有明显差异(P＜0.01),显示高强度聚焦超声能够杀伤原头蚴。加入MBCA悬液的比例较低(1∶1 000)时,对原头蚴的杀伤效应无显著影响,杀伤率与单纯HIFU组相比无明显差别(P＞0.05)。加入MBCA悬液的比例为1∶500时,对原头蚴的杀伤效应有所增强,杀伤率与单纯HIFU组相比差别有意义(P＜0.05)。MBCA悬液与原头节悬液的比例为1∶100、1∶10时,对原头蚴的杀伤效应明显增强,杀伤率与单纯HIFU组相比,差别较大且有统计学(P＜0.01)。加入足量MBCA悬液(1∶2)时,原头蚴接近全部死亡。提示:MBCA悬液结合高强度聚焦超声能增强对原头蚴的杀伤效应,并且随着MBCA悬液与原头节悬液的比例的提高,对原头蚴的杀伤率亦呈增强趋势。根据表1的杀伤率结果,将MBCA 悬液的比例1∶100、1∶10作为进一步试验的参数。

表1 HIFU结合不同比例微泡造影剂对原头蚴的急性杀伤率(%)(±s)Tab.1 The dead rates of protoscolices treated with HIFU and MBCA in different setting proportions initially(±s)

表1 HIFU结合不同比例微泡造影剂对原头蚴的急性杀伤率(%)(±s)Tab.1 The dead rates of protoscolices treated with HIFU and MBCA in different setting proportions initially(±s)

*:为无任何干预措施时,原头蚴的自然死亡率。

分 组 活原头蚴数 杀伤率(%)空白对照组 190±0.17 5.0±0.18*单纯MBCA组 189.98±0.48 4.98±0.37单纯HIFU组 99.03±2.57 50.23±1.89 HIFU联合MBCA(1∶1000)98.36±3.64 49.98±2.37 HIFU联合MBCA(1∶500)90.97±3.54 53.87±2.78 HIFU联合MBCA(1∶100)49.51±2.13 74.67±1.92 HIFU联合MBCA(1∶10) 38.82±1.03 80.45±0.68 HIFU联合MBCA(1∶2) 2.86±1.6297.84±1.56

再次探索微泡造影剂悬液适宜比例的试验中观察到:比例为1∶80时,对原头蚴的杀伤率最高,与比例为1∶100、1∶60时相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。但与较高的比例1∶10时相比,两者杀伤率差别不明显(P＞0.05)。余下各组间相比,对原头蚴的杀伤率差别均无统计学意义(P＞0.05)。

表2 HIFU再次结合不同比例微泡造影剂对原头蚴的急性杀伤率(%)(±s)Tab.2 The dead rates of protoscolices treated with HIFUand MBCA in different setting proportions again(±s)

表2 HIFU再次结合不同比例微泡造影剂对原头蚴的急性杀伤率(%)(±s)Tab.2 The dead rates of protoscolices treated with HIFUand MBCA in different setting proportions again(±s)

*:为无任何干预措施时,原头蚴的自然死亡率。

分 组 活原头蚴数 杀伤率(%)空白对照组 189.64±0.39 5.13±0.29*单纯MBCA组 179.41±0.47 5.38±0.07单纯HIFU组 92.10±3.25 50.77±2.30 HIFU联合MBCA(1∶100)39.45±0.52 79.18±0.37 HIFU联合MBCA(1∶80) 32.62±1.51 82.45±1.33 HIFU联合MBCA(1∶60) 35.69±4.680.59±2.58 HIFU联合MBCA(1∶40) 35.85±2.63 80.92±1.92 HIFU联合MBCA(1∶20) 32.24±2.54 82.45±1.68 HIFU联合MBCA(1∶10) 31.6±0.7783.16±0.56

2.2 对原头蚴的形态观察 普通光学显微镜下观察。对照组与单纯MBCA组:原头蚴形态正常,台盼蓝拒染,体被膜完整,内部小钩、钙颗粒等结构清晰可见,排列有序(图 1:A、B)。单纯HIFU组:约50%原头蚴死亡,台盼蓝着色,但未见被膜明显破损,内部结构大致可以辨别,小钩、钙颗粒所处位置无明显改变(图1:C)。加入较低比例(1∶1000)的MBCA后,原头蚴杀伤率、形态变化与单纯HIFU组相比不明显(图1:D);随着MBCA比例的增大(1∶500),原头蚴杀伤率增加,部分原头蚴变成圆形,体积缩小,台盼蓝染色较深,内部结构不清楚,但亦未见被膜结构明显变化(图1:E)。MBCA比例再增大(1∶80),绝大部分原头蚴死亡,形态变圆体积缩小,深染色,部分死亡原头蚴皱缩,形态不规则,内部结构无法清楚辨别(图1:F)。MBCA比例为1∶10时,原头蚴形态变化与1∶80时相比差别不明显(图1:G)。当MBCA与囊液比例足够大(1∶2)时,原头蚴几乎全部死亡,体被膜完整性被破坏,有散在被膜碎片,可见大量散在的小钩及钙颗粒(图1:H)。

3 讨 论

图1 不同比例MBCA对原头蚴结构的影响(台盼蓝染色,×100)A:对照组:原头蚴结构形态正常,台盼蓝拒染;B:单纯M BCA组:与A组相比无差别;C:单纯 HIFU组:约50%原头蚴死亡,台盼蓝着色,形态结构基本正常(箭头所示);D:MBCA与原头蚴悬液比例为1∶1 000,原头蚴死亡及形态变化与C组相比无明显差别;E:MBCA与原头蚴悬液比例为1∶500,原头蚴缩小变圆,深染色,内部结构不清(箭头所示);F:MBCA与原头蚴悬液比例为1:80,原头蚴深染色,部分皱缩(箭头所示);G:MBCA与原头蚴悬液比例为1∶10时,原头蚴死亡及形态变化与C组相比无明显差别;H:M BCA与原头蚴悬液比例为1:2,见原头蚴被膜碎片,小钩、钙颗粒散落(箭头所示)。Fig.1 The influence of MBCA in various proportions on structures of protoscolices(trypan blue exclusion assay,×100)A:control,alive protoscolices were not stained in blue and their structures were clear.B:the protoscolices treated with MBCA alone,there was any difference compared with group A.C:the protoscolices treated with M BCA alone,the dead rate of protoscolices was 50%,dead protoscolices were stained blue and their structures were somewhat clear(shown as the arrow).D:the proportion of MBCA was 1:1000,the dead rate and structural changes of protoscolices was no difference compared with group C.E:the proportion of MBCA was 1:500,dead protoscolices rounded to smaller sizes,they were stained blue deeply and their structure inside were indistinct(shown as the arrow).F:the proportion of MBCA was 1:80,dead protoscolices were stained blue deeply,some of them shrinked(shown as the arrow).G:the proportion of MBCA was 1:10,the dead rate and structural changes of protoscolices was no difference compared with group F.H:the proportion of MBCA was 1:2,protoscolices were broken into pieces,the numerous hooklets and calcareous bodies were scatted(shown as the arrow)

HIFU是利用超声波的组织穿透性、可聚焦性、能量沉积性等物理特性,将体外声源发射的超声能量聚焦在体内的病灶,比如肿瘤块处,通过高强度超声波在聚焦处产生的热效应、空化效应、机械效应等生物学效应,损伤破坏靶组织结构,从而实现治疗疾病的目的。研究表明,超声不仅可以使细胞膜通透性增加,并且能诱导其凋亡和坏死[5],目前认为空化效应是主要作用机制。空化效应是指组织或液体中的微小气泡核在超声波作用下被激化,通过泡核的振荡、膨胀、收缩等一系列动力学过程,把声场能量高度集中于极小的空化泡内,并且在最后空化泡爆破瞬间把高能量释放出来,同时伴随瞬间放电、发光、冲击波等物理和化学效应。空化效应释放的这些高能量及伴随的效应导致微气泡周围组织的细胞膜被击穿,产生可逆或不可逆的小孔,使细胞膜通透性增加[6]。微泡造影剂是内含不同气体的微气泡,这些微气泡能降低空化效应的阈值,增强超声空化效应[4]。

研究认为,微泡造影剂增强HIFU空化效应的机制主要是:首先,超声造影剂本身作为微小的气泡,可以大大增加单位体积的靶组织内空化核的数量,增强空化起始效应,从而增强空化效应对靶组织的破坏作用[7]。刘玉凤[8]等的研究发现,超声介导造影剂声诺维能促进体外培养的人脐静脉血管内皮细胞凋亡,抑制其活性。其次,改变组织声环境(changing acoustic environment in tissue,CAET)原理,即采用一些方法和措施来改变组织的结构、功能以及声学特性,增加靶区声阻抗值,使声能在靶区组织中尽可能多的沉积[9]。肖雁冰[10]等的研究表明,将具备高声阻抗特性的碘油造影剂注入实验动物羊后,能在不切肋骨条件下增强HIFU对肝脏组织的损伤效果。

本试验研究利用微泡造影剂的效应特点,首次将微泡造影剂引入 HIFU杀伤细粒棘球蚴的研究中,这是研究的创新点所在。微泡造影剂作为外源性空化核被人为加入原头蚴悬液中,大大增加了悬液内空化核的数量和密度,增强超声的空化效应;同时这些空化核也改变了原头蚴悬液这一靶对象的声学特性,增强其内部声阻抗的不匹配性,利于超声声能在液体内尽可能多的沉积。通过这两方面共同作用的结果,使HIFU对原头蚴的杀伤效应增强。

试验结果表明,单纯以50W×30S的HIFU剂量作用原头蚴悬液,对原头蚴的急性杀伤率为50%左右,这与本课题组前期研究的结果一致,再次证实了HIFU对离体原头蚴具有一定的杀伤效应。而仅加入微泡造影剂却不进行超声辐照,对原头蚴杀伤率及形态结构改变没有显著影响,说明微泡造影剂只有经过超声波激发,才能发挥其增效作用。在相同的超声辐照条件下,加入较低比例(1∶1 000)的MBCA时,对原头蚴的杀伤率、形态结构改变没有显著影响。分析原因,认为加入的MBCA比例低,人为引入的外源性空化核数量少,密度低;在相同体积的原头蚴悬液中,每个空化核到作用目标原头蚴的空间距离相对较远,其经过超声激发、崩溃瞬间产生的高能量、冲击波等效应无法或较少波及原头蚴。因此,对原头蚴的杀伤率无明显提高,亦未明显改变原头蚴形态。随着MBCA比例的提高,仍使用相同超声条件辐照,对原头蚴的急性杀伤率呈增加趋势,对原头蚴形态结构的损伤也逐渐加重。这说明,HIFU联合MBCA能增强对原头蚴的急性杀伤效应。再次探讨MBCA与原头蚴悬液比例的试验结果中,MBCA的比例为1∶80时,与MBCA比例为1∶100时相比,对原头蚴的杀伤率有差别;但MBCA比例为1∶80与MBCA比例分别为1∶60、1∶40、1∶20甚至是 1∶10时相比,对原头蚴杀伤率无显著差别。究其原因,认为可能是MBCA与原头蚴悬液比例介于1∶60到1∶10之间时,空化核数量和密度在相同体积的原头蚴悬液内达到饱和,可能有部分空化核未能受超声波激发而发挥作用,故对原头蚴的杀伤率无明显影响。从对机体病变周围组织产生最小负损伤的角度考虑,将实现相同杀伤效应时所需的最小MBCA比例1∶80作为进一步试验的参考条件。试验中还发现,当加入的MBCA比例为1∶2时,对原头蚴的急性杀伤率为97%左右,对原头蚴形态结构破坏严重,被膜崩解成碎片,头钩、钙颗粒四处散落。说明在相同辐照条件下,只要加入足够多的MBCA,使空化核的数量、密度在相同体积的原头蚴悬液中达到过饱和状态,HIFU的空化效应得到增强,几乎就能完全杀灭原头蚴。但试验中考虑到大剂量MBCA的副作用及安全性,故不采用1∶2这一MBCA比例作为进一步试验的参数。

本研究证实高强度聚焦超声结合微泡造影剂能增强对离体原头蚴的杀伤效率,拓宽了高强度聚焦超声结合微泡造影剂的的应用范围,为包虫病的治疗开辟了新的路径。但是,对于超声结合微泡造影剂诱导原头蚴死亡的分子机制还需进一步研究,以揭示超声结合微泡造影剂作用的本质。同时,还应继续探讨高强度聚焦超声辐照剂量、微泡造影剂浓度以及对原头蚴杀伤之间的效应关系,以便优化治疗参数组合,使既能产生最佳的生物学效应,也对机体病变周围组织产生最小负损伤,从而为包虫病的治疗提供一种安全而又有效的方法。

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Effect of high intensity focused ultrasound onEchinococcus granulosusprotoscolices with the aid of microbubble contrast agent

KONG Jing1,YE Bin1,2,ZHANG Jing1,HAN Xiu-min3,YANG Yong-hai3,LI Fa-qi4
(1.Department of Pathogenic biology,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;
2.Research Center for Molecule Medicine and Tumor,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;
3.Institute for Endemic Disease Control,Qinghai Province,Qinghai,811602,China;
4.Institute of Ultrasound Engineering in Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

To investigate the protoscolicidal effects of high intensity focused ultrasound(HIFU)with the aid of microbubble contrast agent(MBCA)on the protoscolices ofE.granulosusin vitro.The different suspensions of protoscolices mixed with M BCA in different proportions were treated with HIFU under the condition of constant parameter of fixed sound intensity(50 Watt)and treatment time(30 seconds).The protoscolicidal effects of HIFU were investigated by the trypan blue exclusion assay,and the structural changes of protoscolices were observed by microscope.It was found that in the treated groups whose protoscolices suspensions were added in suitable proportions of MBCA,the dead rates of protoscolices treated with HIFU and MBCA were more than those in the groups treated with HIFU only(P＜0.05),and the dead rates of protoscolices were related to the dosage of M BCA in a manner of proportion-dependent.It was observed that the protoscolices treated with HIFU and MBCA were damaged,stained deeply,shrinked to smaller sizes,and some dead protoscolices were broken into pieces resulting of the scattered numerous hooklets and calcareous bodies.The trial suggested that the protoscolicidal effect of HIFU can be enhanced by adding of microbubble contrast agent to the hydatid fluids.

high intensity focused ultrasound;microbubble contrast agent;hydatid;protoscolex

R512.6

A

1002-2694(2011)08-0687-05

*国家自然科学基金(No:30972567)资助

叶彬,E,mail:yebina@sohu.com

1.重庆医科大学病原生物学教研室,重庆 400016;

2011-03-19;

2011-05-27