环介导等温扩增检测弓形虫方法的建立

陈道桢,许 飞,葛海燕,徐兰兰,潘淑静,朱 斌*

(1.南京医科大学附属无锡妇幼保健院中心实验室,江苏无锡214002;

2.苏州大学基础医学与生物科学学院医学遗传研究室,江苏苏州 215123）

弓形虫病(Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,TOX）引起的人兽共患寄生虫病,孕妇感染弓形虫常致胎儿畸形、流产、死胎。目前普遍采用ELISA检测弓形虫感染,但敏感性较低且特异性不足;以PCR为基础的分子生物学技术检测虽然快速、灵敏,但普通PCR假阳性太高。LAMP是Notomi等[1]发明的一种新型核酸扩增技术,具有灵敏度高,特异性强,操作简单等优点,本研究在建立并优化LAMP定性检测弓形虫的基础上,首次建立了应用SYBR Green I定量检测及不需电泳的直接观察方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源刚地弓形虫RH株(国际强毒代表株）由南京医科大学寄生虫教研室王勇教授提供;57例孕妇外周血标本由苏州市立医院和无锡妇幼保健院提供,抽取静脉血,EDTA抗凝,-20℃保存。

1.2 主要试剂20×SYBRGreen I购自上海捷瑞公司,限制性内切酶SacI购自TaKaRa公司,Betaine和MgSO4购自Sigma公司,Bst DNA聚合酶购自New England Biolabs公司。

1.3 引物设计根据GenBank中弓形虫B1基因序列(Accession No:AF179871）,利用在线设计软件(http://primerexplorer.jp/e/）设计 LAMP引物,同时设计用于克隆用PCR引物,LAMP扩增区包含于克隆片段中,引物由上海博彩生物公司合成。见表1。

1.4 基因组制备及弓形虫B1基因重组质粒的构建抽取腹腔注射弓形虫速殖子感染3天的小鼠腹腔液200μ l,PBS洗涤,沉淀加入细胞裂解液 ,混合后55℃水浴过夜,经典苯酚氯仿法抽提总DNA。PCR扩增弓形虫B1基因片段大小为351bp,回收PCR产物后与pBS-T载体进行A-T连接、转化,筛选出阳性重组质粒,送上海生物工程有限公司测序鉴定,测得OD260值,计算拷贝数。

表1 LAMP所用的引物及克隆用PCR的引物

1.5 LAMP法扩增体系的建立总反应体积25 μ l,引物浓度为FIP、BIP各1.6 mM;B3、F3各0.2 mM,其他反应成分为0.5 mM dNTPs,0.4M Betaine,20 mM Tris-HCl(pH8.8）,10 mMKCl,10 mM(NH4）2SO4,4 mM MgSO4,0.1%的Triton X-100,以构建的弓形虫B1基因片断重组质粒为模板,调节模板含量 ,取 5 μ l,约 105拷贝,8U Bst DNA 聚合酶 ,混匀,63℃水浴1小时。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.6 LAMP反应体系的特异性从两个方面对该方法的特异性进行评估:用建立的LAMP方法分别对双蒸水、弓形虫基因组DNA、猪肉绦虫基因组DNA、日本血吸虫基因组DNA进行扩增,电泳观察扩增结果;因在LAMP的扩增序列中含有一个Sac I的酶切位点(图1）,对刚地弓形虫LAMP扩增产物进行特异性的酶切,酶切反应20?l体系,包括LAMP扩增产物 3 μ l,10 ×缓冲液 1 μ l,Sac I 1 μ l(5U）,37 ℃消化过夜。

1.7 LAMP反应体系的灵敏性以重组质粒为模板,浓度调整到每反应管分别为103、102、101、100拷贝,进行LAMP反应,结束后2%琼脂糖凝胶电泳。

1.8 LAMP扩增产物的肉眼观察将步骤5中LAMP扩增的双蒸水、弓形虫基因组DNA、猪肉绦虫基因组DNA、日本血吸虫基因组DNA产物保留,向每管加入 20×SYBR Green I 2 μ l,室温下静置 5分钟,然后将其置于紫外光下,观察颜色变化。

1.9 实时定量LAMP及标准曲线的建立在建立的LAMP扩增弓形虫体系的基础上,加入0.4×SYBR Green I,将阳性重组质粒进行10倍倍比稀释,浓度梯度为107-100拷贝/μ l,分别取5 μ L,63℃反应1小时。以起始模板拷贝数的对数为x轴,以阳性反应时间(time-to-positive,TTP）值为y轴绘制标准曲线。

1.10 LAMP方法检测孕妇血液标本提取孕妇外周血标本总DNA,用建立的LAMP体系定性检测,63℃水浴1小时,2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP扩增阳性的外周血标本进行荧光定量LAMP,根据反应的TTP值,由标准曲线外推其弓形虫DNA含量。

2 结果

2.1 弓形虫B1基因阳性模板的制备将重组的弓形虫B1基因阳性质粒送上海生物工程有限公司测序,测序结果与GenBank中弓形虫B1基因序列进行blast比对(比对结果未显示）,鉴定结果表明为本实验所需的弓形虫B1基因630 bp-980 bp(AF 179871）,长度为351个bp,以此为建立LAMP反应的阳性模板。

2.1 LAMP反应检测弓形虫DNA体系的建立通过对影响LAMP反应几个主要因素的优化,我们建立了最适的反应体系,利用该体系,可扩增出LAMP产物特有的梯状条带。

2.3 LAMP反应体系的特异性用建立的LAMP方法分别扩增双蒸水、弓形虫基因组DNA、猪肉绦虫基因组DNA、日本血吸虫基因组DNA,仅弓形虫DNA出现扩增条带(图1）,进一步对扩增产物进行酶切,梯状条带消失,在预期位置出现2条特异条带(图2）。

图1 特异性扩增图

图2 LAMP扩增产物酶切图

2.4 LAMP反应的敏感性检测调整每反应管质粒分别为103、102、101、100拷贝 ,进行 LAMP 反应,如图3,1、2、3泳道均可见特异梯状条带,但亮度渐变暗,4泳道(即反应管中仅有100拷贝）未见特异梯状条带。

图3 LAMP扩增敏感性图

2.5 LAMP扩增产物显色反应LAMP扩增后的反应管中加入20×SYBRGreen I 2 μ l,室温静止 5分钟后紫外光下观察颜色变化(图略）,只有弓形虫基因组DNA的扩增产物线显绿色,而2、3、4管的扩增产物未变成绿色。

2.6 实时定量LAMP及标准曲线的建立反应结束后制作标准曲线,如图4所示,在模板浓度为105-101拷贝/μ l区间内,TTP值与相应起始模板拷贝数之间有良好的相关性,相关系数0.929,扩增效率0.961。

1.7 LAMP方法检测孕妇外周血标本在57例孕妇外周血标本中,LAMP定性检测发现2例阳性,进一步对这2例阳性标本进行定量检测,发现其TTP值分别是24.3和24.6,参照标准曲线,推算其浓度均约为103拷贝/μ l。

3 讨论

图4 荧光定量LAMP扩增标准曲线图

本实验选用的B1基因,是弓形虫基因组中一个串联重复的2.2 kb大小的片段,拷贝数大约35个,高度保守,是目前最为理想的靶基因选择之一。本实验首先制备弓形虫B1基因重组质粒,不但可提供建立体系的阳性模板,同时还利于体系灵敏度的确定,省去了弓形虫速殖子计数的繁琐[2],模板量的确定更简单、准确。

温度、Betaine浓度和Mg2+浓度是影响LAMP反应三个最重要的因素,本实验亦从这三个方面进行优化,发现Mg2+浓度影响最大,4 mM时效果最好,而温度和Betaine浓度影响较小,与现大部分文献报道的温度或Betaine浓度是影响LAMP最主要因素不同[1,3],我们却发现Mg2+浓度对体系影响最大,En等[4]在建立伪狂犬病病毒检测方法时亦发现类似的现象,可见在LAMP方法建立时按常规仅改变温度或Betaine浓度并不一定能得到满意结果。

LAMP的四条引物识别靶基因的六个特定区域,大大提高了扩增的特异性。如图2所示,本体系仅弓形虫DNA出现特有的梯状条带,而其他物种DNA扩增阴性,为保证LAMP扩增产物的特异性,需进一步采用酶切鉴定,如图1所示在扩增区存在一个SacⅠ酶切位点,经SacⅠ酶切后,梯状条带消失(图3）,充分证明了我们建立的检测体系具极高的特异性。

通过建立弓形虫B1基因重组质粒,可以简单准确快速地了解LAMP扩增体系的检测下限,如图4所示当每反应管模板低至10拷贝时仍可见扩增产物,但100拷贝(即1个拷贝）检测不到扩增产物,表明我们建立的体系检测下限为每反应管10拷贝,与李启明等[5]报道的相一致,表明LAMP检测灵敏度比常规PCR要高2-3个数量级。

LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳不仅费时间,且所用的EB是致癌诱变剂,对操作人员有害。为了使 LAMP产物易于观察,本实验加入SYBR Green I,然后在紫外灯下直接观察结果。如图5所示阳性标本显绿色,反之无色。该方法简单易行,特别适合基层单位快速检测。

LAMP反应使dNTPs转化为焦磷酸根,而后者又可与Mg2结合生成焦磷酸镁沉淀,Mori等[6]发现该沉淀的形成与DNA的生成量呈线性关系,且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸收峰,依据此原理可使用浊度仪进行LAMP的定量检测。但是,浊度仪价格昂贵,难以普及。与PCR相似,LAMP产物亦为双链DNA,SYBRGreen I可掺入其中,其信号强度代表了双链DNA分子的数量,而且LAMP在60℃以上反应,与PCR相比,不易产生非特异性产物和二聚体,定量结果更准确。基于以上原理,Cai等[7,8]报道了利用SYBR Green I—LAMP定量检测血清中的乙型肝炎病毒方法。但与PCR经多个循环扩增不同,LAMP在同一温度进行,此时采用Ct值反映检测信号显然是不适合的,因此引入阳性反应时间(Timeto-positive,TTP）的概念,即扩增产物达到检测阈值的时间点,类似于实时PCR的Ct值[9]。本实验也建立了LAMP荧光定量检测弓形虫DNA的方法,由图6可知标准曲线相关系数R2=0.929,扩增效率0.960,表明我们建立的定量方法是可靠的,且具有较高的扩增效率。

为验证该方法应用价值,我们利用建立的LAMP方法对57例孕妇外周血标本进行检测,在定性检测到2例标本有特异扩增,进一步对这2例标本进行定量检测。结果发现阳性率达3.5%(2/57）,与潘卫庆等[10]报道的孕产妇弓形虫感染率3.44%相近。作为方法的初步应用,虽然检测的标本数不多,但表明我们建立的方法具有有效、快速、灵敏等优点,适合于基层医院使用。

总之,本研究建立的定性及定量检测弓形虫基因组DNA的LAMP方法,特异性强、敏感性高、简便快速且低成本,有望在临床应用发挥一定的作用。对于防止孕妇流产、早产、死胎、胎儿畸形等,以及提高人口素质有着重要的价值和现实意义。

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