我国部分地区传染性羊痒病基因型的分布情况调查

肖 妍，董志珍，栾慎顺，陈本龙

（天津出入境检验检疫局，天津 300461）

羊痒病（scrapie）是传染性海绵状脑病（TSE）的原型，是由羊痒病朊病毒引起成年绵羊和山羊的一种慢性进行性的、致死性神经系统疾病，能引起绵羊和山羊中枢神经系统发生退化变性，病羊具有中枢神经系统变性、空泡化、星形胶质细胞增生等特点，瘙痒是痒病的一个显著特征，此外， 共济失调、麻痹、衰弱、震颤、姿势不稳、痴呆、知觉过敏、行为异常等神经症状也是其主要的临床症状，死亡率达100%[1-3]。

羊痒病可通过病羊的肉骨粉等传染给牛，而使牛感染为疯牛病。人食用了被疯牛病病原污染的食品，可感染上传染性海绵状脑病—新变异型克雅氏病（即nvCJD）。因此，羊痒病的诊断是根除和控制疯牛病、克雅氏病的关键。而到目前为止，在检测疯牛病和羊痒病等方面开发出的免疫组织化学方法、免疫转印方法、组织印记法、ELISA方法、western-blot等方法均为死后诊断和确诊法，不利于本病的控制和根除[4-5]。

引起羊痒病的病原是一种无核酸的蛋白质侵染颗粒朊蛋白（Prion protein， PrP），是由宿主神经细胞表面正常的一种唾液酸糖蛋白（PrPc）在三级结构发生改变后形成的异常蛋白（PrPsc），由于英国“疯牛病”的发生使得此蛋白备受研究人员的关注[6-7]。

研究表明， 羊痒病的发生与绵羊朊蛋白编码基因PRNP遗传多样性密切相关，主要表现在绵羊PRNP第136、154和171位密码子组成的PRNP基因型与绵羊对痒病的抗病性相关[8-10]。患有TSE的病羊其基因组中的三个等位基因发生了突变，即136位点上的A突变成了V、154位点上的R基因突变成了H基因，171位点上的Q基因突变成了R或H，研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不会感染TSE，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊则为敏感型，易患TSE[11-13]。也有研究称含有杂合子VRQ/ARR基因型的羊感染了羊痒病，但是当有ARR等位基因和非VRQ等位基因伴随时，羊很少有感染羊痒病的报道。本研究旨在利用已建立的利用荧光定量PCR扩增反应进行单核苷酸多态性（SNP）快速分析的方法对羊痒病抗性基因进行筛选，对我国部分地区的羊痒病基因型分布情况进行调查，从而从品种选育水平上杜绝羊痒病的发生。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

各型绵羊PRNP基因标准品由意大利Institut zooprofi lattic sperimen DELLA SARDEGNA 惠赠 ；基因扩增预混液Taqman Universal PCR MasterMix购于Applied Biosystems试剂公司；基因组DNA提取试剂盒购于TIANGEN试剂公司。

1.2 绵羊基因组DNA的提取

按照TIANGEN血液基因组 DNA提取试剂盒说明提取。

1.3 荧光定量PCR检测

选 取 20 μL PCR 反 应 体 系 ：2×mastermix：10μL；DNA：2 μL；上游引物（10 μM）：2 μL；下游引物（10 μM）：2 μL；FAM标记的探针（10 μM）：0.5μL；VIC 标记的探针（10 μM）：0.5 μL；双蒸水补齐至 20 μL。

样品放入Roche LightCycler 480荧光定量PCR扩增仪进行检测，其实时荧光定量PCR扩增程序如下 ：50 ℃ 2 min ；95 ℃ 10 min ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共35~40个循环，每个循环延伸末期采集数据。

反应结束后立即进行终点读板分型，选择标记探针的两种检测信号FAM和VIC，程序如下：61 ℃预热1 s，60 ℃连续读板，同时收集5个信号。

机器将根据记录的数据将两种荧光信号进行比较计算，自动分型。

2 结果与分析

2.1 实时荧光定量PCR 的扩增

采用终点读板基因分型模式（Endpoint Genotyping）检测483~533 nm通道（FAM）和523~568 nm通道（VIC）的数据，经过计算比较二者的比值，得到基因分型散点图（见图1）。各标准品均按其基因型表现为纯合子（136AA、136VV、154RR、154HH、171RR、171HH、171QQ）及杂合子（136VA、154RH、171RH、171RQ和171HQ），说明引物及探针设计的特异性完全能够用于SNP快速分析。

2.2 样本检测结果

表 1 样本检测结果

基因型分布情况见图2~7。

3 讨论

绵羊的基因型与发生羊痒病有着重要的关系，如表1所列[14]。

不同PrP基因型对羊痒病的敏感性不同，因此筛选出对TSE有抗性的羊群是控制和根除本病的关键，目前的科学研究表明野生基因型ARR/ARR或ARR/ARQ是抗性基因型，具有此基因型的羊基本上不会感染TSE，而ARQ/ARQ、VRQ/ARQ、AHQ/VRH等其它基因型羊则为敏感型，易患TSE，因此可根据朊蛋白的基因型而采取相应的措施和计划来控制羊痒病、疯牛病等。

表 2 绵羊PrP基因型与羊痒病发生的危险性

经过我们对北京、天津、新疆、云南4个地区的254份无角多赛特绵羊血液样本进行基因分型试验，结果表明，ARR/ARR或ARR/ARQ抗性基因型所占比例为44%；基因型ARR/ARH 所占比例为9%，此基因型对羊痒病有抗性，但育种时要选育；对于羊痒病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例为4%，其中新疆所检74份样品中未检出，北京100份样品中检出9份，比例为9%，天津和云南所检40份样品中各检出1份，比例为2.5%。

对于羊痒病有较高易感性的基因型ARQ/ARQ，ARH/ARQ，ARH/ARH，ARH/AHQ，ARQ/AHQ，AHQ/AHQ所占比例分别为27%，10%，3%，1%，2%和0.4%，由此可见，我国以上四个地区的无角多赛特绵羊PrP基因型的分析可知，我国饲养的绵羊抗性基因型的比列占到了53%，一半以上的绵羊具有羊痒病抗性，可以用于育种和基因筛选；对于羊痒病有高易感性的基因型ARQ/VRQ所占比例为4%，对于此基因型的绵羊不能用于育种，应将羔羊宰杀或阎割；对于羊痒病有较高易感性的基因型占到了43%，对于此类型的绵羊对羊痒病有较小的抗性，可以卖掉或在某一阶段用于育种。

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