单核细胞增生性李斯特氏菌快速检测技术研究进展

刘海泉，沈 潇，吴启华，潘迎捷，孙晓红

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.美国缅因大学食品科学与人类营养系，美国 缅因州 04469-5735）

单核细胞增生性李斯特氏菌（LM）简称单增李斯特菌，为革兰氏阳性、兼性厌氧、嗜冷、过氧化氢酶阳性的杆形细菌，目前李斯特菌属有6个种，但只有单增李斯特菌（L.monocytogenes）可导致人类患病，为典型的胞内寄生菌。LM广泛存在于环境中，据WHO报道，健康人的粪便中LM携带率为0.6%～16%，有70%的人可短期带菌，但感染LM后引起的李斯特菌病有高达20%～30%的致死率[1]。2002年单增李斯特菌被WHO列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[2]。

目前有各种各样的快速方法来检测微生物，有免疫学方法、分子生物学方法、生物化学和酶方法、膜过滤的方法、生物传感器以及其他方法。国家标准2008版本GB/T4789.30-2008[3]，一方面增加了全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法和全自动病原菌检测系统筛选法，另一方面由于成熟的商业化试剂和仪器的使用，至少缩短了2 d的检测时间。但是由于增菌时间乃需要至少2 d时间，因此有必要开发完善新的快速检测方法。

1 生物化学和酶学方法

1.1 快速酶促反应显色培养基

目前主要应用的有CHROMagar Listeia显色培养基和3MTM PetrifilmTM测试片。张淑红等在人工污染样品和实际样品检测中，显色培养基CHROMagar Listeria和HK Listeria与传统平板OXA和MMA可以达到相同的检测限和灵敏度，且具有更高的特异性，可大大提高检测效率[4]。王殿夫比较了3MTM PetrifilmTM环境李斯特菌测试片和平板法定量检测肉制品中的LM。结果表明，3MTM Petri－filmTM环境李斯特菌测试片法和平板法检测LM的结果基本一致，适合于肉制品中LM的检测[5]。

1.2 全自动微生物分析系统

随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。由于其操作可实现标准化、而且简便、快捷、准确率高，已成为微生物检测发展的方向之一。现在已有很多全自动微生物分析系统，如VITEK系统、MIDI系统、BIOLOG系统、SENSITITRE系统、AUTOSCEPTOR系统及 MICROSCAN 系统等[6]。

2 分子生物学方法

2.1 探针杂交

DNA探针法利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断，当DNA探针与待测的非标记单链DNA（或RNA）按碱基顺序互补结合时，以氢键将2条单链连接而形成标记DNA-DNA（或标记DNARNA）的双链杂交分子。将未配对结合的核苷酸溶解后用检测系统（放射自显影或酶检测等）检测杂交反应结果。因此利用该方法可以检测样品中是否存在LM，测定放射性或荧光强度可以得出样品中LM的个数。Byron F等针对李斯特属16S核糖体亚单元的特异序列设计了6个荧光标记的肽核酸探针，与整个细胞进行原位荧光杂交[7]。

2.2 PCR（聚合酶链式反应）

PCR是近年来应用最广的分子生物学方法，在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物进行扩增。张辉等针对hly基因建立的PCR方法，具有较强的特异性[8]。李盛丰等针对iap、prfA毒力基因，设计引物，比较了单个PCR、多重PCR、套式PCR等3种方法[9]。Yi Chen等通过设计多条引物建立了多重PCR方法，该方法能够检测李斯特属细菌、LM的1/2a和4b血清型及LM的I、II和III基因型[10]。Alka Mukhopa dhyay等针对大肠杆菌0157：H7的fliCh7基因和LM的iap基因，研究了能同时检测这两种病原菌的多重PCR，其具有专一、快速、敏感的特点[11]。

实时荧光定量PCR技术是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法，广泛用于基因表达研究、转基因研究、病原体检测、药物疗效考核等诸多领域。Enrica等通过双标记的探针和对熔解曲线的分析建立了能同时检测牛奶中的沙门氏杆菌、LM和大肠杆菌O157的多重实时定量PCR[12]。Justin等针对ssrA基因建立了实时定量PCR，其在食品样品中的检测限为（1－5）CFU/25g，利用该方法对 175件食品样品和31件对照进行检测并与ISO方法比较，具有99.44%的特异性、96.15%灵敏度和99.03%准确性[13]。

2.3 基因芯片

基因组研究计划的实施，带动了生命科学研究的革命，基因芯片就是在多种微生物基因组序列被确定之后出现的一种新兴检测技术。这种技术利用从食品微生物中扩增到的序列标记荧光作为探针，与固定在玻片上的成千上万已知DNA序列（主要是细菌）进行杂交，结果可以通过直接的荧光扫描或酶学方法进行测定。由于在一个芯片上囊括了众多的已知菌序列，故可以同时鉴定检测样品中的多种细菌。Sergeev等研制了一种能够检测4种弧形杆菌属、6种李斯特菌、16种金黄色葡萄球菌肠毒素和6种产气荚膜梭菌毒素的DNA芯片，其中LM纯培养的检测限为200 cfu/g[14]。

2.4 依赖核酸序列的扩增检测（NASBA）

该反应依赖于禽源成髓细胞瘤逆转录酶（AMV-RT）、RNaseH和T7 RNA聚合酶，在3种酶的共同作用下，以单链RNA为模板进行核酸序列的扩增。Anna Nadal等发展了分子信标实时NASBA（QNASBA）法检测和鉴定LM，验证了hly基因mRNA序列与QNASBA的效率和灵敏度。该方法能检测到100个目标分子和LM对数期的40个细胞[15]。

3 免疫学方法

免疫学方法是基于抗体、抗原的反应，只需少许样品就可以精确检出抗原，并且不易受基质影响，提供实时信息。目前已有的检测方法有：酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、酶联荧光分析法（ELFA）、乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术等。

Mattingly等首先于1988年报道了针对LM鞭毛抗原的单克隆抗体ELISA检验程序，该法2～3 d内可从自然污染样品中检出LM[16]。Kim等设计了与hly基因PCR扩增的132 bp产物杂交的探针，建立的PCR-ELISA法可以在5 h内检测出10个LM细胞[17]。

Sewell等将 LM 培养增菌至（104～105）cfu/mL 后用自动酶联荧光免疫检测系统（VIDAS）检测。阳性结果检出率为97%，假阴性、假阳性结果检出率为1.9%、3.0%[18]。林涛等采用全自动荧光酶免疫分析仪（mini VIDAS）和国标法相结合，能在48 h内对样品进行快速筛选[19]。

免疫磁性分离技术是在磁性颗粒表面偶联特异性抗体，抗体与样品中被检致病菌发生特异性的结合，在外加磁场的作用下载有致病菌的磁性颗粒向磁极方向聚集，弃掉样品混合液，从而使致病菌不断分离、浓缩。Yang等利用羧基优化改良的纳米磁珠与兔抗LM抗体共价结合，通过胺基在人为污染的牛奶中有效捕捉目标，并与实时PCR结合，可以检测到0.5 mL牛奶或营养肉汤样本中102个细胞[20]。

4 生物传感器检测

生物传感器技术近20 a来有了迅猛的发展，它能满足食品中对病原微生物灵敏、实时检测的要求。Pratik Banerjee等首次使用基于胶原质封装哺乳动物细胞的细胞传感器快速检测病原菌或毒素。把B-杂交瘤细胞、Ped-2E9细胞封装在I型胶原基质构成的多板生物传感器，快速检测致病性李斯特菌活细胞、李斯特溶血素O和苏云芽孢杆菌肠毒素[21]。

5 讨论

食品中病原菌检测的主要问题之一是时间。目前出现了许多鉴定各种病原菌的快速方法，如PCR技术、基因探针、酶联免疫方法等，但大部分还是处于实验室阶段。通常快速鉴定方法是在增菌之后、生化鉴定培养之前进行。这些检测方法适用于对某种阴性结果进行快速评价。但是在可能性非常低的情况下，某些死细胞会与免疫球蛋白结合，或者死细胞的DNA被扩增，使检测结果成假阳性。这也是目前PCR方法和免疫学方法需要解决的问题。因此，当出现阳性结果时，对培养物一定要慎重处理，应继续进行生化实验来确认。另外，各种快速检测方法受到前处理的制约，前处理是目前的瓶颈。做好样品的前处理，就能够在实际食品样品中排除干扰，避免错误结果。因此，只有解决好样品的前处理，快速检测方法才有可能应用到实践。

由于LM分布广，适应能力强，对人类健康威胁大，因此简单快速、灵敏高效、经济实用、自动化程度高的检测技术显得非常重要。但是目前还没有一种方法可以同时兼备以上优点。由于LM的单克隆抗体制备较困难，具有种特异的抗体一直是免疫学方法要解决的问题。样品中由于存在死的致病菌、特异性DNA片段，常常造成PCR检测结果比常规方法假阳性率增大，阳性率变高。

此外，从GB/T4789.30的08版与03版变化可以看出，新技术和新材料的使用，使得检测时间大为减少，但仍以“金标准”的常规培养为主。虽然目前的快速检测手段还有很多问题需要解决，但随着新技术和新材料的出现，以及理论研究的深入，一些技术必将在食源性致病微生物检测和鉴定方面替代经典方法。检测手段固然重要，但是不能因此忽略预防的重要性。执行良好的操作规范（GMP）和良好卫生规范（GHP），并用HACCP体系管理食品的生产和加工，从源头上杜绝LM污染，才是避免LM危害的首选。

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