植物抗病机制与信号传导研究进展

李智强,戴良英,刘雄伦*,王国梁*

(1湖南农业大学农学院,长沙 410128;2湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室,长沙 410128;3湖南农业大学生物安全技术学院,长沙 410128)

在过去的几十年里,尽管在植物病害控制上取得了重大进展,但全人类的粮食供应仍然受到各种病原菌和害虫的严重威胁。许多病原菌和害虫可以利用植物作为食物和住所,如病毒,细菌,真菌,线虫,昆虫,甚至其他植物[1]。植物在进化过程中,形成了一整套的防御机制来识别和抵抗病原菌的侵染。当病原菌入侵植物体后,植物体会产生一系列的变化来消灭病原菌,如过敏性反应(Hypersensitive Response,HR),被感染的植物组织会得到强化,并且产生能够杀伤病原菌的代谢产物,同时诱导与防卫相关基因的表达。HR产生的信号在数小时或几天内使整个组织或植株的防卫基因表达,形成对其他病原菌及后续侵染的抗性,即系统获得抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR),其具有持久性和对病原菌有专化特异性[2]。

对病原菌的特异识别可以激活诱导防卫反应的发生,这一过程主要是由一系列复杂的组成型表达抗性基因(R基因)来完成的。单一 R基因的识别能力非常低,并且要在病原菌含有相应无毒基因(Avr基因)的情况下已能完成识别任务。由这些遗传学特性可以把这一过程描述成一个简单的分子模式:植物以 R基因是否能识别出进入植物体的 Avr基因编码的蛋白为信号来判定病原菌的入侵与否。许多 Avr基因和R基因的克隆以及相关研究已经验证了这一模式。

整个诱导防卫反应必须要在一定的控制之下来完成,否则同时也会给植物体本身带来伤害。因此,诱导防卫反应会在特定的时间与空间内发生。这就要求要有一个复杂的、高度完整的信号调控网络来控制诱导防卫反应的发生。本文概述了植物 R基因和病原菌Avr基因的结构特点、R-Avr基因的互作模式、SA信号传导途径与 JA信号传导途径及其各自重要相关因子的研究进展。

1 R基因

在病原菌侵染的过程中,植物中 R基因编码的受体蛋白可以识别 Avr基因编码的产物蛋白。植物不能像动物那样可以得益于循环抗体系统,所以它们必须依赖于大量 R基因表达产生的对病原菌的抗性。在过去 20年中,从各种植物体中已经克隆到 70多个 R基因,其中一些已经研究的非常清楚。根据这些R基因编码蛋白的结构特点,可以将其分为以下几大基因家族:NBS-LRR(Nucleotide-Blinding Site and Leucine-Rich Repeat),LRR-TM 和 LRR-TM-STK[3,4]。分子遗传学家已经利用R基因序列的特异性和自然变异性进行 R基因的克隆和研究其分子模型[5]。通过图位克隆和转座子标签等方法,这些基因家族都已在烟草、水稻、拟南芥中得到证实。

1.1 NBS-LRR

植物基因组可以编码大量NBS-LRR,即核苷酸结合位点和富亮氨酸重复的胞内受体蛋白。根据其编码蛋白的结构特点,该类基因又被分为四个亚类。第一亚类:LZ-NBS-LRR。 NH2-端有一个亮氨酸拉链(LZ)保守区,它是由7个氨基酸构成的重复序列(保守序列为XXXYXXL,Y代表疏水基团)。第二亚类:TIR-NBS-LRR。NH2-端保守区与果蝇发育基因Toll或哺乳动物免疫中编码白细胞介素-1受体(IL-1R)基因的产物有同源性。第三亚类:TIR(Toll-IL-1R同源区)。该亚类成员有来自烟草的抗烟草花叶病毒的N基因。第四亚类:NBS-LRR。来自番茄的I2和Mi,分别介导对细菌Fusariumox ysporiumf.sp.l ycopersicon和Meloidogyne javanica的抗性。大量的研究表明,LRR的C末端在对病原菌的特异识别过程中起关键作用。然而,最近越来越多的研究表明,NBS-LRR的 N末端在对病原菌的识别过程中也起重要作用[6]。

1.2 LRR-TM

该类基因产物为锚定于细胞膜上的糖蛋白受体,包括 3个区域:LRR结构域,跨膜区域(Transmembrane Domain,TM)和一个较短的胞内区域[8]。

1.3 LRR-TM-STK

如水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的蛋白是一类受体蛋白激酶,它的产物含有STK和 LRR-TM两类R基因的结构特点。

然而,有些 R基因并不属于上述类型中的任何一种。如Rpg5基因编码的蛋白产物有典型的 NBSLRR和一个蛋白激酶结构域,但有趣的是,总有另外一个单基因与其紧密连锁,该单基因编码的产物蛋白是一种未知结构的抗病相关蛋白[9]。另外,抗稻瘟病基因Pi21编码的富含脯氨酸蛋白包括一个假定的重金属结合域,可以推测这可能会形成一种新的蛋白质相互作用模式[10]。

2 Avr基因

近些年的研究表明,能够改变宿主蛋白结构和功能的均为病原菌效应因子中的一些真菌蛋白或小分子物质[11]。 Avr蛋白是一类能够特异识别宿主相应 R蛋白的病原菌效应因子,从而直接或间接激活宿主对病原菌侵染的防御反应。近年来,在对真菌Avr效应因子鉴定方面取得的重大进展,为更为深入的研究真菌致病的分子机制提供了重要的理论依据,也为研究 Av r效应因子与宿主 R蛋白共进化奠定了重要基础。

在已经被定位的 40多个真菌 Avr基因中,有9个已经被成功的分离与克隆。PWL1和PWL2是最先被克隆的两个无毒基因。Orbach等成功的分离出了另一个无毒基因AvrPi-ta,该基因编码一个由223个氨基酸组成的含有一个保守金属蛋白酶域的分泌蛋白[12]。最近,采用图位克隆法,Li等人成功地克隆出了AvrPiz-t基因,通过基因序列比对,未发现与其同源的 Avr基因[13]。 Yoshida等对稻瘟菌全基因组研究发现,生理小种 Ina168基因组中的一段1.68 Mb的序列在生理小种 70-15基因组中是缺失的[14]。更为有趣的是,318个候选 Avr基因均位于这一段基因组序列当中。通过序列比对与遗传关联分析确定了3个新的Av r基因,即AvrPia,AvrPii和AvrPik/km/kp。 这 3个Avr基因均为 N端含有信号肽序列的分泌蛋白。AvrPii和AvrPik/km/kp分别编码含有 85个氨基酸和 113个氨基酸的未知功能蛋白。AvrPii编码的蛋白含有 170个氨基酸,其中包含一个与蛋白质-蛋白质相互作用相关的保守结构域—— LxAR,该结构域是一种典型的锌指结构。有趣的是,LxAR结构域在稻瘟菌中是一种常见分泌蛋白上的重要结构(Yoshida,et al,2009)。该组效应蛋白功能的阐明会为病原菌致病的分子机制研究提供理论基础。

ace1是一种编码属于酮聚合酶 /非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)的杂合蛋白的独特Avr基因。该蛋白在一种聚酮化合物的生物合成过程中起关键作用[15]。在水稻体内,与ace1基因相对应的 R基因为Pi33,而Pi33能够识别的 Avr基因并非ace1基因,而是 ACE1蛋白的次级代谢产物。有趣的是ace1只在侵染植物叶片的成熟附着胞中表达。这些结果表明,ace1的表达与附着胞对植物叶片的侵染过程有关,但不会直接进入水稻细胞引起防御反应。

Avr基因遗传不稳定性与 R基因相应 Av r蛋白的无毒性丧失是造成病原菌 Avr蛋白遗传结构高度多样化的主要原因。病原菌世代较短的特性,使其更容易形成新的 Avr基因与发生致病型改变,这也是使一些高抗的植物品种在几年内丧失抗性的主要原因。最近对Avr基因的研究取得的重大进展,为阐明无毒基因的遗传变异与不稳定性提供了理论基础。通过遗传突变的方法,包括碱基删除、定点突变、转座子插入等,得到了大量的无毒基因。例如,Orbach的研究发现,AvrPi-ta基因的内含子 3和外显子 4的缺失会增加该基因的毒性。另外,转座子插入方法往往可以通过改变基因的表达水平与表达模式而改变 Avr基因的毒性,得到新的 Avr基因。Fudal等发现,在ace1外显子中插入一段 1.9 kb反转录转座子会导致ace1无毒性的丧失[16]。在对AvrPi-ta和AvrPiz-t的研究过程中也发现了同样的现象。

3 R-Avr基因互作模式

由美国农业部的科学家 Harold H.Flor提出的基因对基因假说,也被称为受体-配体模型,认为植物多样性的抗病性反应是以 R基因作为受体蛋白,由病原菌中相对应的Avr蛋白来激活并形成R-Avr复合体,进而激活下游基因而引起的植物生理反应。目前,主要有两种不同的分子机制来解释这一模型:R-Avr直接互作与 R-Avr间接互作。 R-Avr直接互作认为,Avr蛋白与 R基因蛋白直接发生互作,进而引发由 R基因介导的植物抗病反应。例如,在对水稻抗瘟基因Pi-ta的研究中发现,在Pita+中发现了 AVR-PITA直接互作,而在Pita-中未发现 AVR-PITA的直接互作,这一研究成果是证明 R-Avr直接互作的最早的实验证据[17]。然而,到目前为止,还未发现其他的例子证明 R-Avr之间的直接相互作用。与此相反的是,大多数的研究结果表明,R基因与 Avr基因之间往往是通过其他的一些间接性因子来发生相互作用的,这一互作模型往往被称为“防卫”假说[18]。在该模型中,R蛋白质扮演“卫士”来监控目标蛋白质由于与之相对应的 Avr蛋白入侵而发生的结构或构型的改变。该模型最早是通过对AvrPto/AvrPtoB-Pto-Prf介导的植物抗病性的研究发现的。该模型中,Prf很可能是编码典型 LZ-NBS-LRR蛋白质的真正 R基因,而作为Avr蛋白受体的 Pto蛋白则是该基因监控的目标蛋白[18]。同样,拟南芥中的 RIN4蛋白是受到两个编码NBS-LRR蛋白质的RPM1和RPS2基因监控,而RIN4蛋白构型的改变是受 3种不同类型的 Avr基因调控的,包括来自假单胞菌syringae AvrRpm1,AvrB和AvrRpt2基因[19,20]。两个结构类型相差甚大的 Av r蛋白 Av rB与 Av rRpm1,与 RIN4发生相互作用,诱导RIN4的磷酸化反应,进而调控 RPM1介导植物抗病反应。而AvrRpt2是一种半胱氨酸蛋白酶,其主要作用是以 RIN4为靶蛋白并降解其转录产物诱导 RPS2介导的植物对病原菌的防御反应。最近,在对拟南芥的研究中发现,由PBS1基因编码的丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白质受RPS5严格的监控,而这个丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白正是 Avr-RphB蛋白的受体蛋白,这一研究成果进一步证明了“防卫”模型假说[21]。

目前,大量的实验数据表明,植物可能拥有多种不同的防御机制,防止各种病原菌的侵染。植物的R基因与病原菌的Avr基因的共同进化使不同的R蛋白与多样化的 Avr蛋白保持着良好的平衡性[22]。总的来说,在这两个模型假说中,具有保守结构的 R蛋白可以通过与 Avr蛋白发生直接相互作用,或通过作为 Avr蛋白受体的植物内在蛋白而发生间接的相互作用。然而,尽管有各种各样的假说被提出,但 R-Avr之间的相互作用还不是很清楚,需要进一步的研究。

4 植物抗病信号传导

在植物的抗病反应过程中,R基因识别 Avr基因后所产生的抗病信号须由植物体内源信号分子从受侵染部位传导至整株植物,引起系统性抗性,因而植物体内源信号分子在植物抗病信号传导途径中起重要作用。目前研究较为清楚的植物内源信号分子有水杨酸(Salicylic Acid,SA)、 茉 莉 酸 (Jasmonic Acid,JA)。SAR和 HR需要 SA介导,被称之为 SA依赖性途径(SA-Dependent Pathway),这一途径中 PR21蛋白协同表达;ISR是独立于SA与PR21基因的,需要通过植物激素JA介导。Morriseey和Osbourn用JA处理可降解 SA的转基因拟南芥,诱导产生了系统性抗性,说明这一途径与 SA无关,称之为 SA非依赖性途径(SAIndependent Pathway)[23]。

4.1 SA信号传导途径

SA作为植物产生局部抗病反应与系统获得抗性反应(SAR)的重要的信号分子,已被广泛研究。植物对病原菌的侵染会导致其体内 SA含量的显著变化。研究发现,植物体内 SA含量的增加与植物出现抗病反应、编码防卫相关蛋白的基因过量表达表现正相关性。通过基因敲除的方法,沉默 SA合成过程中重要基因,以及通过转基因的方法,将细菌水杨酸羟化酶基因(NahG)转入植物中,均可以有效阻止 SAR的激活,同时,外源 SA也可以激活防卫反应基因的超表达,进而增强植物对病原菌的抗性,产生 SAR。这些实验说明,SA是植物抗病信号传导与 SAR形成过程中必不可少的信号分子。

通过遗传筛选的方法,已经在拟南芥中找到大量参与 SA合成、SA信号传导的基因。npr1基因也被称为nim1基因,是 SA信号传导途经的重要基因之一。npr1基因突变的拟南芥对 SA不敏感,不表达防卫基因,不表现抗病性,但体内仍积累与野生型植株等量的SA[24],说明npr1基因位于 SA信号途径的下游,而在防卫基因表达的上游[25,26]。在拟南芥和水稻中过表达npr1基因可以提高对病原菌的抗性。 SA或其类似物帮助NPR1蛋白转运到细胞核,进而激活下游防卫基因表达。NPR1蛋白包含一个锚蛋白重复结构域,该结构在已知功能蛋白中,是参与蛋白—蛋白互作的重要结构。该结构域突变体证明其对 NPR1蛋白行使正常功能起到重要作用。

4.2 JA信号传导途径

茉莉酸(JA)及其化合物作为植物调节激素,调控着植物种子萌发、果实成熟、花粉形成、根的伸长、卷须缠绕、叶片脱落和衰老等植物生育期的各种生理变化。他们也参与植物对机械伤害、紫外线照射、干旱、病原体侵染和昆虫啃食等伤害的抗性反应。对模式生物拟南芥的各种 JA突变体进行研究,已经发现了大量 JA信号传导通路中的关键因子。

在筛选根伸长 JA不敏感突变体的过程中,得到JA不敏感突变体 jar1,JAR1蛋白属于酰基腺苷酸式萤火虫荧光素酶家族的一员,可以促进生化过程中的一些底物分子参加后序生化反应[27]。COI1突变体是可以耐受细菌冠毒素和茉莉酸甲酯的一种突变体。该突变体是由于 JA诱导基因,包括AtVSP,tive,Thi2.1和PDF1.2发生了突变形成的。该突变体表现雄性不育,并对病原体侵染不具抗性。coi1基因编码一个 66 kD的蛋白质,该蛋白包含一个富含亮氨酸重复结构域和一个N端的F-box结构域。隐性突变体jin1和jin4同样是在筛选根伸长 JA不敏感突变体的过程中得到的。在这两种突变体中,茉莉酸甲酯诱导基因AtVsp的表达量比对照组野生型中的表达量明显降低。jin1基因编码 AtMYC2蛋白,是属于一种螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链类结构的转录因子,该基因的表达受 JA的正调节。 jar1,jin1和 jin4突变体是可育的,而 COI1突变体是雄性不育的。coi1基因对依赖JA调节植物的育性与防御反应是必须的,这一现象说明coi1基因位于 JA信号转导途径的上游。

一般认为,JA与其甲酯(MeJA)是植物体内包括细胞内和植株间可移动的信号分子,但由于目前还未分离和鉴定出 JAs受体,其诱导的植物抗病信号传导途径还不完全清楚[28]。通过对拟南芥 JA不敏感突变体 COI1的研究发现,coi1基因编码一种富含 LRR重复序列与具有 F-box序列的蛋白可以和感应 JA信号的负调控因子(Skp1和 Cullin等)结合而形成一个 E3泛素连接酶复合(SCFCOI1),该复合体可被泛素酶解系统来识别并可以选择性的降解负调控因子,即泛素通过降解SCFCOI1中的抑制因子而保证 JA信号的正常传导[29]。

5 展 望

虽然在植物抗病分子机制方面的研究取得了令人兴奋的成就,但对植物抗病机制的研究仍然是针对某些具体抗病基因本身的一些特点而开展的,而且大多处于描述水平或只确定了不多的一些功能;对植物 R

基因与病原菌 Avr基因识别分子机制的了解还不是很清楚;各种防御信号传导网络模型还不是很完善。因此,只能通过对植物抗病机制进行更为精细的研究,来解决上述问题,才能设计出更为合理、有效的策略,以充分利用植物 R基因、抗病信号传导网络为人类服务。

在短期内,人们期望更多的、有效的 R基因被克隆,同时来自拟南芥的抗病信号传导模型也会被证明适用于其它的农作物[30]。从长远来看,对识别病原菌的结构基础的详细理解,可以更好的设计出完美的抗性蛋白来识别重要的无毒因子。随着功能基因组工具在植物抗病方面得到广泛应用,大大的加快了人们对植物抗病信号传导和其它植物进程中相互作用的新发现和新认识理解的步伐[31]。由于病原菌超强的适应能力,很难轻易得到一个具有持久性、广谱性的抗病材料。但是,令人期待的是,特定的抗病基因在一定的遗传背景下,并且结合其他适当的控制措施,获得稳定的、良好的抗性也是可以实现的。

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