干细胞在犬嗅觉细胞研究中的应用

张 林 洪飞腾

干细胞在犬嗅觉细胞研究中的应用

张 林 洪飞腾

干细胞研究是一门新兴的学科。从植物的生根、发芽、生长、凋亡、复苏，人们看到了干细胞巨大的增殖分化潜能和长久不衰的生命力，体会到了干细胞的神奇和美妙，希望能够依靠干细胞的自我更新、高度增殖和多向分化能力，完美地修复或替代因疾病、创伤、衰老或遗传因素所造成的组织或器官的缺损或功能障碍。近年来，随着科学技术的突飞猛进，使得干细胞的分离纯化、性能研究、培养扩增、诱导分化等有了突破性进展，部分干细胞技术已开始进入临床应用。干细胞生物学的研究与应用几乎涉及了所有生命科学和生物医药学领域，除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗中的重大意义之外，还将在新基因发掘与基因功能分析、发育生物学模型、新药开发与药效、毒性评估等领域产生重要的影响。

一、干细胞的定义

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。干细胞群的功能即为控制和维持细胞再生。一般来说，在干细胞核其终未分化的子代细胞之间存在着被称为“定向祖细胞”的中间祖细胞群，它们具有有限扩增能力和限制性分化潜能。这些细胞群的功能是增加干细胞每次分裂后产生的分化细胞的数量。干细胞具有自我更新的能力，但是干细胞的分裂实际上是相对不对称的。

目前大多数生物学家和医学家认为干细胞是来自胚胎、胎儿或成体体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型和基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。从功能上讲，干细胞是具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。

二、干细胞的生物学特性

多向分化潜能和自我更新是干细胞的基本特点。具体来讲，干细胞具有以下一些生物学特点：①属非终未分化细胞，终生保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记；②在机体的数目、位置相对恒定；③具有自我更新能力；④能无限的分裂、增殖，干细胞可连续分裂几代，也可以在较长时间内处于静止状态；⑤具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞；也即具有分化发育的可塑性，在特定的环境下，能被诱导分化成在发育上无关的细胞类型，其分化受其所处周围微环境的（干细胞壁龛）影响；⑥分裂的慢周期性；⑦干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂，形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂方式，非对称分裂中一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来，另一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。

三、胚胎干细胞的研究

20世纪60年代开始有人对胚胎干细胞进行描述。1962年Edwards首先观察到兔胚泡胚胎干细胞的分化现象，发现胚泡腔内细胞群细胞具有自动分化能力，可以分化为含有神经、骨、肌肉等多种细胞的能力。随后，人们对胚胎干细胞的分离培养进行了大量工作，但由于胚胎干细胞在体外生长极为困难，细胞建系十分不易。经过近20多年的发展，Evans和Kaufman终于在1981年从小鼠胚泡内细胞群中成功分离出胚胎干细胞，当时称之为多能细胞。90年代以来先后报道了鼠、兔、猪、牛、猴等多种动物以及人类胚胎干细胞分离培养，进展十分迅速。1995年，Thomson等从恒河猴胚泡获得第一个灵长类的胚胎干细胞系，在取得灵长类的胚胎干细胞分离和鉴定经验基础上，Thomson又率先从人胚泡内细胞群分离出5个胚胎干细胞系，并初步阐述了人类胚胎干细胞的生物学特性。几乎在同时Shamblott等从发育到5～9周的流产胎儿生殖嵴中分离培养获得人类具有与胚胎干细胞相似的原生殖细胞。人类胚胎干细胞系的建立被誉为生命科学领域的重大技术突破，是生命科学研究史上的重要里程碑。2001年，Wakayama等利用体细胞核移植克隆胚泡的方法，成功地制备了小鼠核移植胚胎干细胞系。Robert等正尝试制备胚胎干细胞的新方法，即不经过胚泡阶段直接从卵裂球获得胚胎干细胞。2003年韩国和美国科学家联手，利用体细胞克隆技术获得人类克隆胚胎干细胞，这一技术的成功表明可以用任何人的自体细胞培育胚胎干细胞，从而使胚胎干细胞向临床应用迈进了一大步。2004年，日本科学家在体外将小鼠的胚胎干细胞诱导分化为精子和卵子细胞，结果进一步证实胚胎干细胞具有向生殖细胞分化的潜能。

四、胚胎干细胞在犬嗅觉细胞研究中的应用

犬的灵敏嗅觉一直是大家津津乐道的话题。犬的嗅觉对空气中或物体表面微量气味的探测以及在众多复杂气体中区分某种或某类气体具有良好的辨别能力一直是我们试图从中探索的研究课题。犬同时具有良好的服从性和可以被训练的特性以及可以和人类友好相处是其他动物所不能比拟的。因此，我们选择犬作为我们的工作伴侣，利用其灵敏的嗅觉，良好的服从性进行各种工作活动。在此基础上，我们把犬的嗅觉作为我们的研究对象，试图找到其中的奥妙。

犬嗅觉高度灵敏的原因可能和它的鼻腔结构、嗅觉细胞以及大脑中掌管嗅觉的区域神经等等有关。嗅上皮位于鼻孔的上部，表现为一个暴露在外部环境中的气体敏感表面。嗅上皮包含了气体感受器系统，在其上覆盖着一层黏液层即嗅黏膜。对人而言，每个鼻孔中的嗅上皮的面积大概为2.5cm2，嗅上皮包含了大量的感受器神经元—嗅细胞。每个嗅细胞上有数根嗅纤毛通过黏液层伸出，从而显著地增加了细胞的表面积。在嗅神经末梢的表面分布着蛋白质感受元，其作用如化学感受器中的感受器，它们与空气中的气体接触，产生刺激反应，最终形成嗅细胞的感受结果。刺激蛋白质感受器的气体分子首先被黏液吸收，然后扩散到纤毛处，与嗅黏膜受体结合。气体分子与感受器反应，增加了嗅纤毛的通透性，改变了嗅黏膜电导，引起膜电位的变化。这样嗅细胞就产生了感受器电位并导致嗅神经纤维产生神经冲动。目前我们主要研究的是犬嗅觉细胞，从嗅觉细胞角度上来查找出高度灵敏的特殊性。既然我们把犬嗅觉细胞作为我们的研究对象，那么我们就必须得到大量的实验材料——犬嗅觉细胞。

胚胎干细胞具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，因此，我们可以选用犬胚胎干细胞，通过体外培养，再经过定向诱导分化，筛选出我们需要的犬嗅觉细胞。通过方法我们可以得到大量的实验材料，进一步开展犬嗅觉细胞的研究工作。

从犬胚胎干细胞定向诱导分化出犬嗅觉细胞的大致步骤是：先从犬胚胎中筛选出相应的细胞团；然后再在体外和饲养细胞一起进行培养，进行细胞扩增；再筛选出良好的干细胞集落；把该细胞集落打散，继续接种培养，筛选出单细胞；再继续培养筛选出核型正常的单细胞集落；在此基础上对该单细胞克隆进行扩增，建立相应的细胞系。该细胞系就能够稳定地进行体外传代培养，从而可以获得大量的实验用犬嗅觉细胞材料。

公安部南京警犬研究所，210012）

（编辑：李 冰）