应用微生物生产维生素C的研究进展

程朝彬，陈建华

维生素 C（vitamin C，VC）即 L-抗坏血酸（L-ascorbic acid，L-AA），是一种水溶性维生素，最早从肾上腺中分离得到[1]。人体中缺乏 L-古龙酸-1,4-内酯氧化酶（L-gulono-1,4-lactone oxidase），无法自身合成 VC，必须依靠膳食摄取[2]。VC 生理功能广泛，普遍用于临床治疗中[3]。此外，VC 在食品饮料、化妆品和饲料等工业中有着广泛用途[4]。VC 应用范围的增加迅速加剧了市场需求，全球每年 VC的需求量约为 8 万吨，其中 55% 用于医药工业；35% 用于食品和饮料工业；10% 用于养殖工业[1]。

20 世纪 30 年代以前，VC 主要从柠檬中分离提取，价格高昂，远不能满足人们的需要。1933 年首次实现用L-木酮糖（L-xylosone）化学合成 VC，在此基础上 Bremus等[5]引入一步生物发酵将 D-山梨醇（D-sorbitol）转化为L-山梨糖（L-sorbose），实现从 D-葡萄糖化学合成 VC，并用于工业化生产。“莱氏法”经过大量的优化改进，然而由于其高能耗，一些化学反应需要高温、高压条件，易造成环境污染等[6]，各国学者一直致力于寻找更经济、有效的替代工艺。于是，微生物转化法的生物技术工艺逐渐被重视。这里，我们主要概述近年来用微生物生产 VC 的研究进展。

1 细菌合成 VC

在过去的 30 年中，利用细菌生物转化替代现有的莱氏化学合成法生产 VC 的研究取得丰硕成果。已发现的可用于生产 VC 的细菌，多数不能直接合成 VC，一般是先合成一种关键中间体 2-酮基-L-古龙酸（2-keto-L-gulonic acid，2-KLGA），再经甲醇酯化得到 VC。这些细菌以 D-葡萄糖（D-gulose）、D-山梨醇或 L-山梨糖为底物，根据生产2-KLGA 的生物途径和菌株不同可分为：单菌株发酵、混菌株发酵和基因工程菌株发酵。

1.1 单菌株发酵

Sugisawa 等[7]报道一株突变菌株，葡萄糖酸杆菌IFO3293（Gluconobacter melanogenus IFO3293）能以 D-山梨醇或 L-山梨糖为底物发酵生产 2-KLGA，最终产量分别为 50% 和 60%，但发酵过程中产生副产物 L-艾杜糖酸（L-idonic acid）等，发酵液中分离纯化 2-KLGA 困难，阻碍其用于工业生产。早前研究认为只有葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）、醋酸杆菌属（Acetobacter）和假单胞杆菌属（Pseudomonas）能以 D-山梨醇和 L-山梨糖为底物合成 2-KLGA，但 Urbance 等[8]从生酮基古龙酸菌属（Ketogulonicigenium）中分离出 2 株菌可以将 20 g/L 的L-山梨糖转化为 9.3 g/L的 2-KLGA，最近研究报道用普通生酮基古龙酸菌 DSM 4025（Ketogulonicigenium vulgare DSM 4025）在 110 h 连续发酵过程中，可以将 114 g/L L-山梨糖转化为 112.2 g/L 的 2-KLGA，其平均底物转化产物的产率可达 91.3%[9]。

另有研究报道，K. vulgare DSM 4025 活细胞或静息细胞均可利用 D-山梨醇、L-山梨糖、L-葡萄糖（L-gulose）和L-山梨醛（L-sorbosone）直接合成 VC，该菌目前报道最高的产量是以 5 g/L L-山梨醛为底物发酵制得 1.37 g/L的VC[10]。此外，Rao 和 Sureshkumar[11]利用放射性诱变野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）得到的新菌株可利用 D-葡萄糖直接合成 VC。与用化学方法从 2-KLGA 内酯化合成 VC 相似，X. campestris 通过内酯化 2-KLGA 合成 VC。在合适的培养基中该菌可以将 D-葡萄糖转化为20.4 g/L的 VC，是酵母用 D-葡萄糖直接合成 VC 产量的14 倍。

1.2 混合菌株发酵

20 世纪 70 年代初，我国科学家建立了一种工业生产VC 的混菌发酵工艺，因其由两个发酵步骤组成，故又称为“二步发酵法”。该方法是目前唯一成功应用于大规模工业生产维生素 C的微生物转化法，国内的 VC 生产厂家均采用该法，并转让给许多西方生产厂商（如 Roche 公司等）[3, 12-13]。

二步发酵法是在莱氏一步发酵将 D-山梨醇转化为 L-山梨糖之后，再利用混合菌培养发酵将 L-山梨糖转化为VC 的前体 2-KLGA[5]，其第二步发酵是由产酸菌——氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）和其伴生菌混合发酵完成。该混合菌发酵体系中，氧化葡萄糖酸杆菌单独培养困难且产酸能力很低；伴生菌单独培养容易，不产酸，但可以促进氧化葡萄糖酸杆菌的生长和产酸。能与氧化葡萄糖酸杆菌混合培养并促进其生产 2-KLGA 的伴生菌有很多，除常用的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）外，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢杆菌（Bacilus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）及苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）等均有该作用[12,14]。对于伴生菌和产酸菌之间的生理和代谢关系目前研究认为：氧化葡萄糖酸杆菌中含有 2-KLGA 合成所必需的关键酶，而伴生菌在发酵过程中产生几种蛋白质或者小分子物质[15]，这些组分的作用从而促进小菌产生 2-KLGA。但大小菌之间具体的伴生机制仍需进一步研究。

二步发酵法中 2-KLGA 的合成路线，Bremus 等[5]给予详细的阐述：第一步发酵，D-葡萄糖经中间体 D-葡萄糖酸（D-gluconate）和 2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D- gluconate）最终氧化成 2,5-二酮基-葡萄糖酸（2,5-diketo-D- gluconate），此过程是由欧文菌（Erwinia）或醋酸杆菌（Acetobacter）发酵完成。第二步发酵，一株棒状杆菌（Corynebacterium）完成 2,5-二酮基-葡萄糖酸到 2-KLGA 的转变，该反应是由还原型辅酶 II（NADPH）依赖 2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶（2,5-diketo-D-gluconate reductase）催化完成的。因此，联合几种微生物如条纹假单胞菌（Pseudomonas striata）、氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydan）和棒状杆菌可以实现以 D-葡萄糖酸为底物直接合成 2-KLGA。

1.3 基因工程菌株

最早在草生欧文菌（Erwinia herbicola）中实现遗传重组，构建的工程菌能以葡萄糖为底物生产 2-KLGA。将Corynebacterium sp. 中 2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶转化至草生欧文菌，得到的工程菌能以 D-葡萄糖为底物直接发酵生产 2-KLGA。在葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase）、葡萄糖酸脱氢酶（gluconate dehydrogenase）、酮葡萄糖酸脱氢酶（ketogluconate dehydrogenase）和 2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶的作用下，构建的工程菌发酵 120 h 内 2-KLGA的产量达到 120 g/L[16]。

在野生葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）中仅有少数菌株可以在 D-山梨醇脱氢酶（D-sorbitol dehydrogenase）、L-山梨糖脱氢酶（L-sorbose dehydrogenase）和 L-山梨醛脱氢酶（L-sorbosone dehydrogenase）作用下以 D-山梨醇为底物合成 2-KLGA，其最终产率很低[17-18]。而通过基因工程改造葡萄糖杆菌属菌株，可实现大量生产 2-KLGA[19]。Saito等[20]将 G. oxydans T-100 中编码 L-山梨糖脱氢酶和 L-山梨醛脱氢酶的基因转入 L-山梨糖（L-sorbose）生产菌株 G.oxydans G624 中，得到重组菌株可以高产 2-KLGA，产量达到130 g/L，是野生菌株产量的 230%。

另有研究报道，将液化醋化醋杆菌（Acetobacter liquefaciens）编码 L-山梨醛脱氢酶的基因转入 G. oxydans IFO 3293 中，新构建的工程菌展示出很高的 L-山梨糖或L-山梨醛转化 2-KLGA 的活性[21]。该工程菌株静态细胞发酵系统利用 L-山梨糖生产 2-KLGA 的产量可达 40 g/L。

Shibata 等[22]将 G. oxydans 中编码 D-山梨醇脱氢酶、L-山梨糖脱氢酶和 L-山梨醛脱氢酶的基因重组入一株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），经优化培养基后，重组菌株可以将 50 g/L 的底物 D-山梨醇转化为 16 g/L 的产物2-KLGA。但其中 15 g/L 的 D-山梨醇仍留在发酵液中未被利用，因此为使该重组菌用于工业生产，需提高 D-山梨醇脱氢酶基因的表达水平或选育能适应高浓度山梨醇的菌株。

基因工程菌研究成果很多，重组的菌株或多或少的可以生产 2-KLGA，但没有一株菌是可以直接将 D-葡萄糖、D-山梨醇或者它们的氧化物转化为 VC。因此，可以转化2-KLGA为 VC 的酶引起了学者的兴趣。最近，Berry 等[23]报道 D-山梨醛脱氢酶能将 L-山梨醛转化为 VC，相关的基因克隆自 G. oxydans N44-1 并可在同株菌种高表达。新菌株的静息细胞实验，可以将 10 g/L的 L-山梨醛转化为4.2 g/L的 VC。

如上所述，目前实现工业利用 D-葡萄糖或 D-山梨醇生物合成 VC 仍然有很长的一段路。因此，今后研究重点主要在提高基因表达、优化发酵条件、限制副产物生成等。

2 酵母合成 VC

虽然在酵母浸出液中发现了 VC，但自然条件下的酵母并不能合成 VC。相反，酵母可以合成一种 VC 类似物D-红抗坏血酸（D-erythroascorbic acid，D-EAA）[1]。尽管该物质的结构与 VC 不同，但其具有相似的氧化-还原性质，在酵母中起着与 VC 相似的抗氧化作用[24]。因此，D-EAA 可代替 VC 运用于工业生产中，但 D-EAA 没有抗坏血病作用，因此其商业价值不及 VC[5]。

研究发现酵母中合成 D-EAA 最后的两步与植物中合成 VC 的步骤极其相似。D-阿拉伯糖（D-arabinose）被转化为 D-阿拉伯糖胶-1,4-内酯（D-arabinono-1,4-lactone），最后被氧化为 D-EAA，该过程中分子结构构型改变与植物中L-半乳糖（L-galactose）经 L-半乳糖-1,4 内酯（L-galactono-1,4-lactone）合成 VC 的分子构型改变完全相同[1]。可是，此过程中相关的酶 L-半乳糖-1,4内酯化脱氢酶（L-GL-DH，植物）和 D-阿拉伯糖胶-1,4-内酯氧化酶（D-AL-Ox，酵母细胞）的催化性质完全不同。体外实验表明从白色念珠菌（Candida albicans）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分离纯化的 D-AL-Ox 不仅可以催化利用 L-阿拉伯糖胶-1,4-内酯（L-arabinono-1,4-lactone），还可以利用 L-半乳糖-1,4-内酯（L-galactono-1,4-lactone ）和 L-古龙酸-1,4-内酯（L-gulono-1,4-lactone）。此外，C. albicans还能以 L-半乳糖-1,4-内酯为底物发酵生产 VC[25-26]。

酵母中催化合成 D-EAA 最后两步中的 D-阿拉伯糖脱氢酶（D-arabinose dehydrogenase, D-Ara-DH），同样有着广泛的底物适用范围。体外实验证明，从 C. albicans 和S. cerevisiae中分离的该酶不仅可以利用 D-阿拉伯糖合成D-阿拉伯糖胶-1,4内酯，还可以利用 L-半乳糖合成 L-半乳糖-1,4-内酯。S. cerevisiae 中相关功能基因已被克隆，并且敲除该基因会导致该菌合成 D-EAA 功能的完全缺失[27]。另据研究显示 S. cerevisiae 经 L-半乳糖孵育后细胞内有VC 生成，这有可能是因为内源性的 D-AL-Ox 和 D-Ara-DH 活性所致[25]。

D-EAA 生物合成的多种途径为开拓酵母一步发酵生产VC 提供新的研究方向。目前已经有报道经基因工程改造的S. cerevisiae 和拜耳结合酵母（Zygosaccharomyces bailii）可以生产 VC。过表达 S. cerevisiae 中 D-Ara-DH 和 D-ALOx 可显著增加其以 L-半乳糖为底物生产 VC 的能力。在出芽酵母细胞转入内源性的 D-AL-Ox 和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 L-半乳糖脱氢酶（L-galactose dehydrogenase），构建的工程菌可以转化 40% 的底物 L-半乳糖，得到100 mg/L 的 VC[28]。

然而，酵母不能合成 L-半乳糖或其衍生物，需要外部供给。这些物质的成本较高，使得该生产方法不经济，解决方案：①筛选可以利用廉价的底物合成 L-半乳糖的细菌菌株，并与酵母混合发酵；②构建载有合成 D-EAA 全部基因的原核生物工程菌；③利用遗传工程改造酵母使其载有合成VC 的全套基因，以期适用于工业生产。

3 微藻类合成 VC

尝试使用微藻这种廉价的原料直接生产 VC 是近年来微生物生产 VC 新方向。Running 等[29]报道淀粉核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）可以一步发酵 VC，该野生型的细胞 VC 产量仅 40 mg/L，经化学诱变和对发酵条件的优化，其产量可提高至 2 g/L。但大部分的 VC 存留在微藻的细胞内，目前该方法仅被用来制作高营养的动物饲料和食品添加剂[1]。Running 等利用诱变育种技术得到 1 株 Prototheca moriformis ATCC 75669，可以将合成的 VC 分泌到胞外，同时 VC 产量比原始菌也有很大的提高[30]。

此外经过不断改良品系，Running 等[30]从原壁菌属（Prototheca）选育出众多能够合成VC 的突变株，这些突变菌株被用于帮助研究一条涉及含有甘露糖的中间体生物合成 VC的途径。在植物中，D-葡萄糖经 GDP-D-甘露糖（GDP-D-mannose）、GDP-L-半乳糖（GDP-L-galactose）、L-半乳糖合成 L-葡糖酸-1,4-内酯，最终 L-半乳糖-1,4-内酯被 L-GL-DH 转化为 VC。该途径最早分别由Bremus等[5]在 P. moriformis 和尚增振等[31]在高等植物中发现。

微藻中 VC 合成途径的阐明有助于其在基因工程上的改造，从而提高 VC 产量并用于工业化生产。但由于微藻培养的缓慢生长速度和代谢活性，要实现其工业生产 VC仍有很长一段路要走。

4 展望

目前，用于工业化生产 VC 的方法主要是“莱氏法”和“二步发酵法”。“莱氏法”因其种种弊端，已经失去了 VC生产的主导地位。而“二步发酵法”虽然解决了莱氏化学合成过程的“三废”等问题，但该方法涉及二步三种菌，菌种传代困难，操作工序繁琐，不能直接把葡萄糖作为发酵原料。因此，今后的研究重点是利用基因工程技术，重组构建新型工程菌株，实现以葡萄糖为底物直接生产 VC 的一步发酵途径。

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