利多卡因氯己定气雾剂无菌检查法的验证试验

胡文红 王德利

利多卡因氯己定气雾剂为复方制剂，其主要组分为利多卡因、醋酸氯已定和苯扎溴铵，用于一般割伤、擦伤软组织损伤、灼伤、晒伤以及蚊虫叮咬、热痱瘙痒等。根据《中国药典》2010年版二部规定，用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂需进行无菌检查。笔者按《中国药典》2010年版二部规定无菌检查验证试验用的4株细菌、2株真菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉)对两个生产厂家的样品进行了无菌检查的验证试验，以确认所采用的方法是否适合于该制剂的无菌检查［1］。现将结果报告如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 BSC-1500ⅡA2-X生物洁净安全柜;MJ-250I生化培养箱;GHP-9270隔水式恒温培养箱;SartoriusCP225 d电子天平;HTY-2000B集菌仪(杭州泰林医疗器械厂生产);PY220、PY330一次性全封闭集菌器(杭州泰林医疗器械厂生产)。

1.2 培养基 营养琼脂培养基 (100409)、玫瑰红钠琼脂培养基(090518)、营养肉汤(090922)、改良马丁培养基(100108)、硫乙醇酸盐培养基(100323)均购于北京三药科技开发公司

1.3 稀释液(冲洗液) pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液购于北京三药科技开发公司、含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(自配)。

1.4 实验用样品 利多卡因氯己定气雾剂(规格：60 g/瓶)分别为山东京卫制药有限公司(批号：0904008)、济南为民制药有限公司(批号：091020)

1.5 菌株 大肠埃希菌(Eschrichia coli)［CMCC(B)44 102］、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64941］、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］、白色念珠菌 (Candida albicans)［CMCC(F)98 001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］均购于中国生物制品检定所医学菌种保藏中心，以上菌种均为第3代菌种。

2 方法与结果

2.1 菌液制备［1］按《中国药典》2010年版二部附录“无菌检查法”项下方法制成小于100 cfu/ml的菌悬液。

2.2 验证试验

2.2.1 样品的取样量 根据《中国药典》2010年版二部无菌检查法的有关规定［1］，验证试验时每一株验证菌株需要的样品量相当于每一滤筒的样品量。按此样品的规格：60 g/瓶，取样量为5瓶/筒，且每瓶取样量不少于1 g/瓶，共5 g，混匀后，备用。

2.2.2 稀释液的选择试验 取本品5瓶/筒，且每瓶取样量不少于1 g/瓶，共5 g，混匀后，分别转移至200 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作稀释液中，振摇后，取PY220一次性全封闭集菌器(两联)一套，按薄膜过滤法处理，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗液分别冲洗滤膜3次，每次100 ml/膜，泵入相同培养基后，于两筒中分别接入小于100 cfu/ml的试验菌。前者作为阳性对照筒，后者作为试验筒。各试验菌同法操作。再取硫乙醇酸盐培养基及改良马丁培养基分别泵入另两筒集菌器中，作为阴性对照筒。按规定温度将述集菌器培养3～5 d。其结果见表1。

表1 稀释液的选择试验结果

2.2.3 表1结果表明，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作稀释液，在规定温度培养后，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌均有抑制作用，各试验筒均未有菌生长，阳性对照筒生长良好;但对大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉无抑制作用，试验筒和阳性对照筒均生长良好;而用含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作稀释液，在规定温度培养后，对验证试验用的6种标准菌株均无抑制作用，各试验筒和阳性对照筒均生长良好。

2.2.4 冲洗液的选择试验 取本品5瓶/筒，且每瓶取样量不少于1 g/瓶，共5 g，混匀后，转移至200 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，振摇后，取PY220一次性全封闭集菌器(两联)一套，按薄膜过滤法处理，分别用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、含1%聚山梨酯80的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗液分别冲洗滤膜3次，每次100 ml/膜。以下操作步骤同前。其结果见表2。

表2 冲洗液的选择试验结果

2.2.5 表2结果和表1结果完全一致。从以上试验结果可知，把1%聚山梨酯80加在稀释液或冲洗液中作为中和剂来消除药品的抑菌作用效果是一样的。两个生产厂家的产品同法操作，结果也完全一致。

2.2.6 中和剂的验证试验［2］证明一种中和剂是否适当主要基于两点，一是对微生物生长的毒副作用，二是有效性。

毒副作用：方法同上。取1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 ml滤过集菌器，分别泵入100 ml硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基，再分别接入小于100 cfu/ml的各试验菌。按规定温度培养、观察。结果见表3。表3结果显示，用于无菌检查验证试验用的6株试验菌株在此条件下均生长良好。

表3 毒副作用试验结果

有效性：由表1、2中可见，在pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中添加1%聚山梨酯80，不筒当稀释液还是冲洗液，都能有效地降低药品的抑菌性，使检验方法简化、便于操作，提高准确性，符合验证试验要求，可以作为中和剂。

3 利多卡因氯己定气雾剂无菌检查方法

取本品15瓶/3筒，且每瓶取样量不少于1 g/瓶，共15 g，混匀后，转移至200 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(或含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液)稀释液中，振摇，经薄膜过滤法处理，用含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液)作冲洗液分次冲洗(每膜不少于300 ml)，每次100 ml/膜，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅪH)，应符合规定。

4 讨论

4.1 中和剂的浓度 在实验过程中，笔者还分别对1%聚山梨酯80、3%聚山梨酯80、5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行了考察，试验结果显示，三个浓度的中和剂均有一定的中和作用。但随着浓度的增加，缓冲液的粘稠度也随之增强，振摇后，泡沫也随之更加丰富，对滤膜过滤不利。因此，一般情况下，建议选用1% ～3%聚山梨酯80就能满足此样品的试验要求。

4.2 中和剂的选择 本样品处方中主要成分之一苯扎氯铵为季铵化合物，是目前广泛应用的抗菌剂，它对革兰氏阳性菌作用强，但对大肠埃希菌、抗酸杆菌等无效。据文献报道，聚山梨酯80为非离子表面活性剂，可降低季铵类化合物、酚、醛、对羟基苯甲酸类、洗必泰类、石炭酸类药物的活性［3］。利用这一特点，本文通过验证试验建立了以1%聚山梨酯80为中和剂的利多卡因氯己定气雾剂无菌检查方法，结合薄膜过滤法，有效去除其抑菌活性。另外，针对一些药物存在某些抑菌活性问题，在无菌检查的过程中筛选可降低其活性的中和剂的思路，为其他品种药物中和剂的筛选提供了选择方向。

［1］中国药典 .2010．二部：Appendix，103．

［2］霍秀敏，微生物检查方法验证与评价要求.药品技术评审论坛，2008，3：50．

［3］苏德模，马绪荣.药品微生物学检验方法.北京：华龄出版社，2007：216．