北京市平谷地区番茄枯萎病病原鉴定

李 园 张大燕 徐文元 郭美霞 曹坳程

（中国农业科学院植物保护研究所，北京100193）

枯萎病主要危害番茄（Lycopersicum esculentumMill.）、辣椒等作物的茎部维管束。发病初期，植株中、下部叶片在中午时呈褐色萎蔫，早晚恢复正常；随病害发展，植株中、上部更多叶片开始发病萎蔫，但不脱落；至最后全株叶片萎蔫发黄，整株枯死。病症有时仅出现在茎的一边，或一片叶一边发黄而另一边正常。剖视茎、叶柄及果柄，可见其维管束均呈褐色。潮湿环境下，病株茎基部产生粉红色霉（黄绍岗，1994；徐艳辉 等，2008）。病程进展较慢，15～30 d才枯死，无乳白色黏液流出，有别于青枯病。发病率15%～20%，严重时植株全部枯死，对产量造成很大的损失（程爱昀，2010）。本试验对北京平谷地区的番茄枯萎病病株进行分离、纯化，运用分子生物学技术对病原菌进行诊断鉴定，以期为防治番茄枯萎病提供参考。

1 材料与方法

1.1 番茄枯萎病病组织采集

2010年 12月于北京市平谷区温室进行样品采集，主要采集番茄病株的茎、叶部分 5～10株，将所采集的番茄病组织（图1）保存于4 ℃ 冰箱备用。

图1 供试番茄枯萎病病组织

1.2 番茄枯萎病病原分离与鉴定

采用PDA+S培养基对采集到的番茄枯萎病病原菌进行分离。培养基成分：1 000 mL灭菌水，38 g马铃薯葡萄糖琼脂，5 g琼脂，0.05 g硫酸链霉素。病原菌的分离培养采用常规组织分离法，从病株根部切下3 mm×3 mm×1 mm的小块，放入70%酒精消毒30 s，然后转入1%次氯酸钠溶液浸泡2 min，用无菌水清洗3次，置于PDA+S培养基上，在25 ℃培养箱内恒温培养7 d（郑莉 等，2006）。培养皿内观察病菌形态。

1.3 菌丝体收集及DNA提取

在无菌操作台上，用刀片轻轻刮下培养皿中病原菌菌丝，并将其收集至 EP管中。采用TakaRa试剂盒进行DNA提取。

1.4 PCR鉴定

PCR 反应体系（50 μL）：5 U·μL-1Taq酶 0.25 μL，10×PCR buffer（Mg2+plus）5 μL；2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 4 μL；10 ng模板 DNA 1 μL；10 μmol·L-1ITS1/ITS4引物各 1 μL；灭菌双重蒸馏水补足至50 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 mim；95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行检测，电压85 V，电泳时间30 min，Bio-rad凝胶成像仪进行观测、拍照。

1.5 数据分析

试验数据在GeneBank中进行Blast （http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）序列比对，分析序列同源性。

2 结果与分析

2.1 番茄枯萎病病原菌

如图2所示，对采集到的番茄枯萎病病原进行分离培养后得到的菌落呈圆形，菌丝细绒状，蓬松。菌落呈白色或边缘白色，向内逐渐变成粉红色。

图2 番茄枯萎病病原菌菌落

对番茄枯萎病病原菌菌落进行显微镜镜检，该病原菌大型分生孢子镰刀形，无色，弯曲，2～5个隔膜，多数为3个隔膜，大小为（19～45）μm×（2.5～5.0）μm，基部具足细胞；小型分生孢子椭圆形或卵形，无色，单孢或双孢，大小为（5～26）μm×（2.0～4.5）μm；厚垣孢子球形，多数单孢，平滑或皱缩，顶生或间生。初步认定该病原菌为镰刀菌。

2.2 番茄枯萎病病原分子鉴定

番茄枯萎病病原 ITS-PCR鉴定结果如图3所示，条带大小为500～700 kb，清晰单一，PCR产物直接送华大基因公司进行测序。

2.3 序列信息及比对结果

测序结果显示，ITS序列全长为538 bp，GeneBank中 Blast序列比对结果显示，与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）序列同源性高达 100%；另一份样品测序结果显示，ITS序列全长为 534 bp，GeneBank中 Blast序列比对结果显示，与串珠镰刀菌（Fusarium proliferatum）序列同源性高达99%。

图3 番茄枯萎病病原ITS-PCR鉴定结果

3 小结

经过病原菌的分离纯化、形态学观察及分子生物学技术鉴定，初步结果表明北京市平谷地区番茄枯萎病主要由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染所致。另外也可能存在串珠镰刀菌（Fusarium proliferatum）的复合侵染。

程爱昀.2010.大棚番茄枯萎病的诊断和防治新技术.中国瓜菜，（1）：45-46.

黄绍岗.1994.番茄枯萎病及其防治方法.广西植保，（3）：29-30.

徐艳辉，李烨，许向阳.2008.番茄枯萎病的研究进展.东北农业大学学报，39（11）：128-134.

郑莉，朱秋珍，冯自立，黄俊斌.2006.草莓枯萎病病原菌鉴定及其生物学特性.湖北农业科学，45（2）：194-196.