RP-HPLC 法测定小儿清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量

黄丽玫，谢植基，毋福海（广东药学院，广州市 510310）

小儿清肺化痰口服液是由麻黄、黄芩、葶苈子、前胡、炒紫苏子等8味药材经提取制成的中药成方制剂，具有清热化痰、止咳平喘之功效。临床用于小儿风热犯肺所致的咳嗽，症见呼吸急促、咳嗽痰喘、喉中作响等。其现行标准采用高效液相色谱（HPLC）法测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、黄芩苷的含量[1]。已有HPLC法测定黄芩苷含量的报道[2]，但槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量测定还未见文献报道。葶苈子为方中主药，系常用中药，具有止咳平喘、消肿利尿及强心之功效。药理研究表明，葶苈子具有强心、止咳、平喘、抗菌、降血脂、抗癌等多方面作用[3]。葶苈子来源于十字花科植物独行菜Lep id ium apetalumWilld.或播娘蒿Descurainia sophia（L.）Webb.ex Prantl.的干燥成熟种子，后者习称南葶苈子。南葶苈子的化学成分研究近年受到关注[3～6]，其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷是近年来从南葶苈子中分离得到的化合物，仅存在于南葶苈子中[5]，为2010年版《中国药典》含量测定指标成分[7]。为进一步评价该制剂的质量，笔者建立了小儿清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量测定的反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，该法具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于该产品的质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1100 HPLC仪（美国安捷伦公司），包括Agilent 1100系列双元泵、Agilent 1100可变波长检测器、Agilent 1100/化学工作站；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，工作频率100 kHz，输出功率400 W）。

槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111854-201001）；小儿清肺化痰口服液（北京长城制药厂，批号：10050102、09040301、10070601，规格：每支10 mL）；乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入30%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷浓度为100 μg·mL－1）。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取小儿清肺化痰口服液10 mL，置于蒸发皿中，于水浴上加热挥干，加入30%甲醇溶解，移至25 mL容量瓶中，用30%甲醇稀释至刻度，超声处理15 min，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液用0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 取处方组成中除葶苈子外的其余成分制成不含葶苈子的阴性对照，按“2.1.2”项下的制备方法处理，即得阴性对照溶液。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液（9∶91）；流速：0.8 mL·min－1；检测波长：260 nm；进样量：10µL；柱温：25℃。分别取对照品溶液（槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷浓度为30 µg·mL－1）、供试品溶液和阴性对照溶液10µL注入HPLC仪，理论板数以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰计算应不低于5 500；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的拖尾因子为0.96，保留时间约为26.8 min，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰与其他组分峰的分离度＞1.5；阴性样品不干扰测定，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品贮备液，加30%甲醇稀释成槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷浓度为5、10、20、30、40、50、60 μg·mL－1的溶液。依次进样10µL，每个浓度测定3次以上。以峰面积（A）对对照品溶液系列浓度（C）进行回归，得槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷回归方程A＝14.24C－5.12，r＝0.999 9。结果表明，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷检测浓度在5～60µg·mL－1范围内与峰面积积分值线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取浓度为30µg·mL－1的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品溶液10µL，连续测定5次。结果，其峰面积的平均值为424.3，RSD＝0.72%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液（批号：10050102）在0、2、4、6、8、10、12 h 分别进样10 µL，记录峰面积。结果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰面积的平均值为389.3，RSD＝0.83%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 取同一批号（批号：10050102））样品适量，共6份，按“2.1.2”方法提取，按“2.2”项下色谱条件测定。结果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的平均含量为69.0 µg·mL－1，RSD＝0.65%，表明重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密量取同一批号样品（批号：10050102）适量，共6份，加入相应量的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品，照“2.1.2”方法处理，并按“2.2”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的平均加样回收率为104.2%，RSD＝0.50%，详见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.4 样品含量测定

取小儿清肺化痰口服液样品适量，共3批，照“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液（30 μg·mL－1）与供试品溶液各10 μL，注入HPLC仪，按“2.2”项下色谱条件测定，计算样品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量，结果详见表2。

表2 样品含量测定结果（n≥3）Tab 2Results of sample determination（n≥3）

3 讨论

南葶苈子药材有效部位中，含有以槲皮素、山柰酚、异鼠李素为苷元的多种系列黄酮类化合物，其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量最多，特征性较强，且具有较好的专属性和平喘有效性，因此含量测定选择以其为指标成分。

笔者在试验过程中考察了不同提取溶剂（30%甲醇、甲醇、甲醇-盐酸）的提取效率，发现以30%甲醇为溶剂提取较完全；对溶剂用量、提取方式（回流、超声）、提取时间进行了优化后，确定了文中供试品的制备方法。

参照文献方法[8]以甲醇-水为流动相，梯度洗脱，峰形较差，分离度无法满足要求。改用乙腈-0.1%醋酸（11∶89）为流动相[7，9]，出峰太快，经比较后以乙腈-0.1%醋酸（9∶91）为流动相峰形较好，分离度符合要求。

检测波长为254 nm[7，9]测定时，小儿清肺化痰口服液样品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰附近有干扰，参照文献[8]，选定260 nm为测定波长，灵敏度高，且槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰附近无干扰。

综上所述，本试验采用RP-HPLC法测定小儿清肺化痰口服液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量，方法学验证表明，其精密度、稳定性、加样回收试验和重复性均能满足定量的要求，可用于小儿清肺化痰口服液的质量控制。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：495.

[2] 李美月，施夏蓉，唐元军.HPLC法测定小儿清肺化痰口服液中黄芩苷的含量[J].海峡药学，2008，20（6）：61.

[3] 孙 凯，李 铣.葶苈子化学成分和药理作用的研究进展[J].中草药，2002，33（7）：附3.

[4] 王爱芹，王秀坤，赵海誉，等.南葶苈子化学成分与质量研究[J].中国药物与临床，2005，5（1）：5.

[5] 王爱芹，王秀坤，李军林，等.南葶苈子的化学成分分离与结构鉴定[J].药学学报，2004，39（1）：46.

[6] 孙 凯，李 铣.南葶苈子的化学成分[J].沈阳药科大学学报，2003，20（6）：419.

[7] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：313.

[8] 王爱芹，王秀坤，闫兴丽，等.HPLC测定南葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量[J].中国中药杂志，2004，29（10）：959.

[9] 李进冉，黄文华，郭宝林，等.南葶苈子药材含量标准的研究[J].药物分析杂志，2010，30（5）：950.