Fractalkine对类风湿关节炎患者成纤维样滑膜细胞中NF－κB活化及内源性fractalkine mRNA表达的影响*

郭兴华， 潘云峰△， 宋泽蓉， 王 昆， 古洁若

(中山大学附属第三医院1风湿免疫科，2骨科，广东 广州 510630)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性炎症，影响世界上0.5% －1%的人群。滑膜炎症细胞浸润以及衬里层增生是其典型病理表现。增生的衬里层主要由巨噬细胞样滑膜细胞和成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast－like synoviocyte，FLS)组成。小分子炎症介质(花生四烯酸代谢产物)、生长因子、趋化因子、黏附因子、基质金属蛋白酶等触发滑膜细胞的增殖和活化，侵袭并损坏关节软骨、软骨下骨、肌腱和韧带。因此，炎症因子对类风湿关节炎的发生和发展都有重要的作用。而传统的NF－κB通路在类风湿关节炎的炎症进程中有重要地位。NF－κB是可诱导型二聚体转录因子家族中的一员，它拥有5个成分，分别是:Rel(c－Rel)、RelA(p65)、RelB、NF－κB1(p50/p105)和 NF－ κB2(p52/p100)。RA 发病中众多细胞因子和细胞黏附分子被激活受到NF－κB的转录调控［1］。同时，RA滑膜表达的许多炎症介质又可作用于NF－κB使其活化，如TNF－α和IL－1β［2］，两者构成一反馈机制，导致 RA 炎症反应和结构破坏得以维持与发展。

Fractalkine(FKN)，又称 CX3CL1，是 CX3C类趋化因子中的唯一成员，由373个氨基酸组成的大分子蛋白。CX3CR1是FKN的高亲和力受体，属于趋化因子受体超家族成员。Chandrasekar等［3］在动脉平滑肌细胞中发现，FKN可通过NF－κB诱导平滑肌细胞的增殖。RA－FLS可分泌游离的FKN［4］，但FKN对RA－FLS NF－κB活化及内源性FKN的表达有无影响，尚未见相关报道。本研究观察FKN刺激RA－FLS后，对细胞中NF－κB活化以及内源性FKN mRNA表达的影响，以期了解FKN对RA中NF－κB活化以及炎症维持和发展的影响。

材料和方法

1 标本采集

类风湿关节炎患者滑膜组织来自2009年3月－2009年8月中山大学附属第三医院行关节置换术，共3例，均取自髋关节。年龄24－50，平均36.3岁，病程8－9年，平均102个月。所有RA患者诊断符合1987年美国风湿病学会(American Rheumatism Association，ARA)类风湿关节炎分类标准。

2 主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司;重组人fractalkine(CX3CL1/FKN)购自PeproTech;培养细胞RNA提取试剂盒、含裂解液、去蛋白液、漂洗液、DEPC处理水、吸附柱、过滤柱、离心管(1.5 mL)和收集管(2 mL)购自北京天根生化科技有限公司;Fermentas RevertAid第1链cDNA合成试剂盒、含DEPC处理水、Oligo(dT)18引物(0.5 g/L)、5×反应缓冲液，Ribolock RNA酶抑制剂(20 g/L)、dNTP混合物和ReverAid M－MuLV反转录酶(2×108U/L)购自 Fermentas;2×Taq Plus PCR Master Mix(预染)购自北京天根生化科技有限公司;DNA marker 1购自北京天根生化科技有限公司;引物由广州英骏生物技术有限公司合成;核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;靶Ⅰ抗:兔抗人抗NF－κB p65单克隆抗体(C22B4)购自Cell Signaling;小鼠抗人抗TATA结合蛋白(TATA －binding protein，TBP)单克隆抗体(MAB3658)购自Millipore;兔抗人抗磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗体购自广州艺佳生物;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记Ⅱ抗购自武汉博士德。

3 方法

3.1 细胞培养 滑膜组织经无菌条件下处理后，向滑膜组织滴加1－2滴20%FBS培养液，将其锐性剪碎至约1 mm×1 mm×1 mm大小，将组织块移至培养瓶中，均匀摆放到瓶底，将培养瓶翻转，使组织块面位于上方，加入适量20%FBS培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中约5 h。将培养瓶轻轻翻转，使组织块浸没于培养液中，避免将组织块冲起。置于培养箱继续培养。根据细胞的生长情况及培养液的变化，每1－3 d更换培养液1次。当细胞生长至覆盖底面＞80%时，可进行消化传代培养。经消化传代后获得较纯成纤维样滑膜细胞［5］。本实验均使用第3代滑膜细胞。

3.2 NF－κB活化检测 RA－FLS中加入100 μg/L FKN，分别作用0 h、1 h、2 h后收集细胞，用核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒提取胞核及胞浆蛋白，用Western blotting检测其胞浆及胞核中NF－κB p65蛋白表达的变化，即取25 μg蛋白(胞核或胞浆蛋白)，经10%SDS－PAGE电泳分离，电转印到PVDF膜，取膜于5%封闭液中封闭，恒温摇床摇2 h;洗膜5次后，加入Ⅰ抗(NF － κB p651∶300，TBP 1∶500，GAPDH 1∶500，取抗体稀释液稀释)，反应1 h，洗膜5次，每次间隔5 min，加HRP标记Ⅱ抗(1∶1000，取抗体稀释液稀释)，反应1 h，洗膜5次，每次间隔5 min，加入增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)化学发光液，3－5 min后于暗室显影后冲洗胶片。用Quantity One软件进行分析，读取吸光度值(absorbance，A)，计算各样本胞浆和胞核中NF－κB p65与胞浆内参(GAPDH)和胞核内参(TBP)的吸光度比值，作为样本的相对吸光度值，以观察各样本胞浆及胞核中NF－κB p65蛋白表达量的变化。

3.3 RT－PCR检测RA－FLS中FKN mRNA表达RA －FLS中加入100 μg/L FKN，分别作用0 h、12 h及18 h后收集细胞，用培养细胞RNA提取试剂盒提取总RNA，用Fermentas RevertAid第1链cDNA合成试剂盒合成 cDNA，即总 RNA 11 μL和 Oligo(dT)181 μg，70 ℃ 反应 5 min，再加 5 × 逆转录缓冲液4 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL、dNTP Mix(各10 mmol/L)2 μL，37 ℃ 反应 5 min，再加 RevertAid M －MuLV RT 1 μL，42 ℃反应60 min，最后 70 ℃反应10 min，产物用作PCR。用2×Taq Plus PCR Master Mix(预染)行PCR，引物为:CX3CL1正义链5’－TACCTGTAGCTTTGCTCATCCA－3’，反义链 5’－ACCACAGACTCGTCCATTCC－3’，产物长度为250 bp;β－actin正义链 5’－ CGGGACCTGACTGACTACCTC－3’，反义链 5’－ACTCGTCATACTCCTGCTTGC－3’，产物长度为547 bp。PCR反应总体积为20 μL，含RT 产物1 μL ，2 ×Taq Plus PCR Master Mix10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 8 μL。反应程序:95℃ 5 min后，95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃15 s，35个循环后再72℃ 8 min。扩增产物于含溴化乙啶琼脂糖凝胶中进行电泳。以目的条带与βactin的电泳条带的吸光度值比值作为mRNA的相对表达量并与对照组比较。

4 统计学处理

用SPSS 13.0统计分析软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差()表示，各组间总差异比较用单因素方差分析，两组间差异比较采用LSD法。

结 果

1 重组人FKN对RA－FLS NF－κB活化的影响

结果显示，FKN刺激后1 h后胞浆中NF－κB p65蛋白表达量较对照组(0 h)降低(P＜0.05)，见图1。2 h后胞核中NF－κB p65蛋白表达量较对照组(0 h)升高(P＜0.05)，见图2，提示FKN对RAFLS中NF－κB有激活作用。

2 重组人FKN对RA－FLS中FKN mRNA表达的影响

RA－FLS中加入100 μg/L重组人FKN分别作用0 h、12 h、18 h，图3 显示刺激18 h后 FKN mRNA表达量高于对照组(0 h)(P＜0.05)，提示在0－18 h范围内，随着时间延长，FKN促进RA－FLS内源性FKN mRNA表达增加。

讨 论

Figure 1.Effect of FKN on NF－ κB activity in RA －FLS cytoplasm.NF－κB p65 protein of cytoplasm was detected by Western blotting 0 h，1 h and 2 h after treatment with 100 μg/L FKN..n=3.*P ＜0.05 vs 0 h group.图1 FKN对RA－FLS胞浆中NF－κB的作用

Figure 2.Effect of FKN on NF－κB activity in RA －FLS nucleus.NF － κB p65 protein in nucleus was examined by Western blotting.0 h，1 h and 2 h after 100 μg/L FKN treatment..n=3.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 h group.图2 FKN对RA－FLS胞核中NF－κB的作用

Figure 3.Effect of FKN on the expression of FKN mRNA.RAFLS were stimulated with 100 μg/L FKN，and FKN mRNA expression was detected by RT－PCR at different time points.M:DNA marker 1..n=3.*P＜0.05 vs 0 h group.图3 FKN对RA－FLS中FKN mRNA表达的影响

NF－κB是一种广泛表达的转录因子，诱导许多炎症细胞和炎症介质产生并导致疾病进展［6］。本实验运用了NF－κB活化后从胞浆转移胞核的原理，检测胞浆和胞核内p65蛋白表达的变化，以证明NF－κB通路是否被活化。实验中显示，当加入100 μg/L FKN 1 h后，胞浆中的p65蛋白即减少，而2 h后胞核中的NF－κB p65蛋白上升，提示当加入FKN后1h NF－κB p65开始转移至胞核，2 h后可检测出胞核内p65蛋白上升，即FKN可激活NF－κB通路。在类风湿滑膜中有丰富的NF－κB，免疫组化分析证实在滑膜衬里层的细胞核中存在p50和p65表达量比较丰富，尤其是 p65的表达［7］。NF－κB参与了RA炎症中许多细胞因子的表达，在与RA有密切关系的基因的表达中发挥关键作用，如单核细胞中的IL－1β、滑膜细胞中的 ICAM －1、TNF－α、IL－6和IL－8。同时滑膜细胞还产生许多酶，这些酶可以降解细胞外基质，破坏软骨和骨质。NF－κB抑制剂可抑制人巨噬细胞和初期RA滑膜细胞这些破坏性酶(如金属蛋白酶、蛋白聚糖酶)和炎症因子(如IL－1β、IL－6、IL－8和 TNF－α)的产生，提示 NF－κB是这些酶和炎症因子合成的基础因素［8］。因此，FKN对NF－κB的活化可促进炎症发展、软骨和骨质的破坏。

进一步实验发现，当加入外源的FKN刺激RA－FLS 18 h后，可表现出其促进内源性FKN mRNA表达的作用，提示RA－FLS中可能存在FKN正反馈现象。在RA患者关节中存在各种各样的炎症因子，部分还可提升FKN表达，起到放大作用，如IFNγ和TNF－α［9］。FKN的这种正反馈作用及其它炎症因子的放大作用可导致RA关节内FKN大量聚集。FKN有黏附、趋化、促进细胞渗出的作用，因此其大量聚集可影响前炎症细胞在关节内浸润和导致CX3CR1+细胞聚集。表达 CX3CR1的细胞包括Th1、Tc1、γδT、NK 细胞、大部分 CD16+NK 细胞、多数的CD14+单核细胞和部分的CD3+T细胞。Th1和Tc1细胞可分泌IFN－γ、TNF－β和IL－2，介导针对细胞内抗原的免疫反应和器官特异性的自身免疫反应。γδT细胞和 NK细胞可表达 CD57、CD11b(细胞毒淋巴细胞的有效标志)和分泌穿孔素和粒酶B。这些提示CX3CR1+细胞是高选择性的趋化细胞毒作用的淋巴细胞(包括NK细胞、细胞毒T细胞和γδT细胞)［10］。这致使大量细胞毒淋巴细胞在关节内聚集，炎症进一步扩大。

除了介导迁移，FKN和CX3CR1还可增强炎症细胞的破坏能力。游离FKN可诱导NK细胞渗出和增强其脱颗粒和溶解细胞的作用，表达CX3CR1的CD8+T细胞具有更强大的细胞毒作用［10］。Yoneda等［11］报道，用固化的FKN刺激NK细胞，或用表达FKN的细胞与NK细胞共培养，可明显上调IFN－γ。Nanki等［12］报道表达 CX3CR1的 CD4+和 CD8+T 细胞在RA患者中增多，这些T细胞都产生IFN－γ和TNF－α。IFN－γ又可促进内皮细胞中FKN的表达［13］，这样一个旁分泌正反馈循环，导致RA关节中FKN进一步积聚，继而趋化更多细胞毒作用的淋巴细胞迁移至关节中，并且这些淋巴细胞的作用被加强，最终可能加重RA关节中炎症程度和关节的破坏。

在RA滑膜中，CX3CR1可在巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和树突状细胞中表达。这提示FKN还可能对这些细胞产生生物效应。CD68+CD16+［14］和CD14+CD16+单核细胞表达CX3CR1，细胞通过CD16与CX3CR1相互作用聚集在滑膜衬里层及滑膜下层中。CD14+CD16+单核细胞表达一些特殊类型的表面分子，而且可产生TNF－α、IL－1β和IL－6，低表达或不表达抗炎因子IL－8，因此这群细胞可迅速地迁移至炎症部位，迅速成熟为促炎症巨噬细胞。游离FKN还可诱导单核细胞分泌IL－1β和IL－6［15］。滑液中CD14+单核细胞表达FKN和CD3+T细胞表达CX3CR1分别与晨僵和肿胀关节数有关［15］。Volin等［16］发现 pmol/L 及 nmol/L 级的游离FKN对人微血管内皮细胞均有趋化和激动的作用，可诱导更多内皮小管形成，将固化有FKN的基质胶移植到小鼠中，可见新血管形成。FKN还可促进MMP的分泌，进而导致软骨的破坏［17］。

进入核内的NF－κB识别共同的DNA序列，调节一系列靶基因，特别是参与人体免疫系统和抵御病原体的基因的表达，包括许多细胞黏附分子、趋化因子及急性反应蛋白等［3］。RA发病中众多细胞因子和细胞黏附分子受到NF－κB的转录调控，如细胞因子(如 TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－2、IL－12、IFN － γ、GM －CSF、EGF［18］)、细胞黏附分子(如选择蛋白、VCAM －1、ICAM －1)，化学增活素(如 IL－8、MIP－1α、MCP －1、RANTES、嗜酸细胞活化趋化因子)、基质金属蛋白酶(MMP－1、MMP－3、MMP－13)、受体(如 MHC)和诱导酶(如 COX－1、iNOS)［19］。本实验结果提示 RA－FLS中可能存在FKN正反馈现象，FKN对NF－κB有活化作用。在平滑肌细胞中，NF－κB的活化可增加 FKN的表达［3］。在 RA －FLS中，NF－κB的活化是否增加FKN的表达，FKN基因启动子中是否存在NF－κB的结合位点，有待后续研究进一步探讨。

［1］Roman－blas JA，Jimenez SA.NF－κB as a potential therapeutic target in osteoarthritis and rheumatoid arthritis［J］.Osteoarthritis Cartilage，2006，14(9):839 －848.

［2］Lee YR，Kweon SH，Kwon KB，et al.Inhibition of IL －1β － mediated inflammatory responses by the IκBα super－repressor in human fibroblast－ like synoviocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，378(1):90－94.

［3］Chandrasekar B，Mummidi S，Perla RP，et al.Fractalkine(CX3CL1)stimulated by nuclear factor κB(NF －κB)－ dependent inflammatory signals induces aortic smooth muscle cell proliferation through an autocrine pathway［J］.Biochem J，2003，373(2):547 －558.

［4］Volin MV，Huynh N，Klosowska K，et al.Fractalkine is a novel chemoattractant for rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocyte signaling through MAP kinases and Akt［J］.Arthritis Rheum，2007，56(8):2512－2522.

［5］肖楚吟，潘云峰，郭兴华，等.滑膜成纤维细胞的原代培养及生物特性［J］.中国医学工程，2010，18(2):1－4.

［6］韩 梅，温进坤，刘月平，等.大鼠血管新生内膜形成过程中NF－κB的活化和ICAM－1及COX－2表达的变化［J］.中国病理生理杂志，2008，24(2):257 －260.

［7］Sioud M，Mellbye O，Forre O.Analysis of the NF－κB p65 subunit，Fas antigen，Gas ligand and Bcl－2 －related proteins in the synovium of RA and polyarticular JRA［J］.Clin Exp Rheumatol，1998，16(2):125 － 134.

［8］Bondeson J，Lauder S，Wainwright S，et al.Adenoviral gene transfer of the endogenous inhibitor IκBα into humanosteoarthritis synovial fibroblasts demonstrates that several matrix metalloproteinases and aggrecanases are nuclear factor－ κB － dependent［J］.J Rheumatol，2007，34(3):523－533.

［9］Fraticelli P，Sironi M，Bianchi G，et al.Fractalkine(CX3CL1)as an amplification circuit of polarized Th1 responses［J］.J Clin Invest，2001，107(9):1173 －1181.

［10］Umehara H，Bloom ET，Okazaki T，et al.Fractalkine and vascular injury［J］.Trends Immunol，2001，22(11):602－607.

［11］Yoneda O，Imai T，Inoue H，et al.Membrane bound form of fractalkine induces IFN－γ production by NK cells:a role for Th1 response［J］.Eur J Immunol，2003，33(1):53－58.

［12］Nanki T，Imai T， Nagasaka K， et al.Migration of CX3CR1－positive T cells producing type 1 cytokines and cytotoxic molecules into synovium of patients with rheumatoid arthritis［J］.Arthritis Rheum，2002，46(11):2878－2883.

［13］Bazan JF，Bacon KB，Hardiman G，et al.A new class of membrane － bound chemokine with a CX3C motif［J］.Nature，1997，385(6617):640 －644.

［14］Yano R，Yamamura M，Sunahori K，et al.Recruitment of CD16+monocytes into synovial tissues is mediated by fractalkine and CX3CR1 in rheumatoid arthritis patients［J］.Acta Med Okayama，2007，61(2):89－98.

［15］Ruth J，Volin M，Haines K，et al.Fractalkine，a novel chemokine in rheumatoid arthritis and in rat adjuvant induced arthritis［J］.Arth Rheum，2001，44(7):1568 －1581.

［16］Volin MV，Woods JM，Amin MA，et al.Fractalkine:A novel angiogenic chemokine in rheumatoid arthritis［J］.Am J Pathol，2001，159(4):1521 － 1530.

［17］Murphy G，Caplice N，Molloy M.Fractalkine in rheumatoid arthritis:a review to date［J］.Rheumatology，2008，47(10):1446－1451.

［18］Nah SS，Won HJ，Ha E，et al.Epidermal growth factor increases prostaglandin E2production via ERK1/2 MAPK and NF－κB pathway in fibroblast like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis［J］.Rheumatol Int，2010，30(4):443－449.

［19］徐 波，邢 丞，李 敏，等.醛肽类蛋白酶体抑制剂对LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症介质表达的影响［J］.中国病理生理杂志，2009，25(5):988－992.