蛋白酶体抑制剂MG132对脑室室管膜下区神经干细胞增殖潜能的影响*

赵云鹤，张卫国，朱 茜，杨桂姣，陆 利

(山西医科大学人体解剖学教研室，山西 太原 030001)

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是中枢神经系统的原始细胞，具有自我更新和多向分化潜能[1]。NSCs不仅存在于发育中的中枢神经系统，而且还富集于成年哺乳动物侧脑室室管膜下区(subventricular zone，SVZ)、海马齿状回(dentate gyrus，DG)、嗅球等脑区[2]。有报道证实，随年龄增加，体内NSCs增殖能力下降、数量减少，而且这种由于机体内环境失衡所致的干细胞库耗竭是多种老年性疾病的共同病因[3]，其潜在的机制亟待阐明。蛋白酶体是新近受到关注的蛋白水解酶复合体，它通过选择性降解泛素化的靶蛋白参与维持内环境稳态，介导细胞多种生命活动过程。有关蛋白酶体功能活性与NSCs增殖能力的相关研究尚未见报道。为此，本研究拟应用蛋白酶体抑制剂MG132注射入成年小鼠侧脑室，通过5－溴－2'－脱氧尿嘧啶核苷(5－bromo－2'－deoxyuridine，BrdU)掺入实验动态观察蛋白酶体活性改变对NSCs增殖能力的影响，为神经退行性疾病发病机制研究提供新思路。

材料和方法

1 材料

清洁级BALB/c小鼠，由山西医科大学实验动物中心提供。蛋白酶体抑制剂MG132购自碧云天生物技术研究所，蛋白酶体活性检测试剂盒为Millipore产品，BrdU购自Sigma，山羊血清封闭液购自博士德生物工程有限公司，BrdUⅠ抗购自Millipore，山羊抗鼠CY3荧光Ⅱ抗购自Sigma，DAPI荧光封片剂为Vector产品。

2 方法

2.1 动物分组 选择90日龄、体重(20±2)g、清洁级BALB/c小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组(实验组3 d、7 d、14 d 组和对照组3 d、7 d、14 d 组)，每组10只。实验组侧脑室注射蛋白酶体抑制剂MG132(10 g/L，DMSO稀释)，对照组注射等体积DMSO。侧脑室注射3 d、7 d、14 d后每组5只小鼠提取SVZ总蛋白，检测蛋白酶体活性;另5只小鼠进行BrdU腹腔注射标记NSCs，免疫荧光染色，检测SVZ BrdU+NSCs数量。

2.2 蛋白酶体抑制剂MG132侧脑室定位注射 小鼠以3%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于江湾I型脑立体定位仪，手术区备皮、消毒，正中线切开皮肤，暴露前囟，参照小鼠脑立体定位图谱[4]于前囟前0.67 mm，左侧旁开0.6 mm，垂直进针，进针深度2.2 mm。将 1 μL MG132(10 g/L)，缓慢注入侧脑室，注射完毕留针5 min再缓慢退出，缝合头皮，术后保温饲养。另设DMSO溶剂对照组，左侧侧脑室注射 1 μL DMSO。

2.3 蛋白酶体活性检测 提取SVZ总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将30 μg总蛋白加入蛋白酶体活性检测反应体系，37℃孵育2 h，SPECTRAMax－M2e荧光酶标仪380 nm(激发光)/460 nm(发射光)处测定荧光强度。计算实验组和对照组荧光强度比值，统计学软件进行数据分析。

2.4 BrdU腹腔注射标记NSCs 配制BrdU(6 g/L)溶液，按30 mg/kg给予小鼠腹腔注射，每隔2 h注射1次，共注射6次。于末次注射24 h后灌注取材，Leica恒冷箱切片机进行连续冠状切片，片厚16 μm，收集两侧胼胝体连接起始处至前连合连接部位(前囟+1.10 mm至前囟+0.14 mm)的所有脑片。

2.5 免疫荧光染色 脑片丙酮浸没，2 mol/L HCl 37℃水浴孵育17 min打开DNA双链;BrdUⅠ抗4℃孵育过夜;荧光Ⅱ抗37℃孵育2 h;DAPI封片液封片，Olympus荧光显微镜下观察、摄片，计数各组胼胝体连接起始处至前连合连接部位所有脑片SVZ BrdU+NSCs数量，统计学软件进行数据分析。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差()表示，多组间的比较采用One－way ANOVA方差分析，两组间比较采用t检验。

结 果

1 BrdU免疫荧光染色

BrdU腹腔注射24 h，免疫荧光染色可见BrdU+NSCs分布于侧脑室SVZ，阳性细胞密集排列于侧脑室背外侧区，见图1A－a。BrdU+着色部位为细胞核，形态为圆形或椭圆形，可与细胞核特异性荧光染料DAPI，见图1A－b;重叠呈现粉红色，见图1A－c。MG132注射侧和对侧BrdU+NSCs数量无显著差别(P ＞0.05)，见图1B。

Figure1.Immunofluorescent staining of BrdU in SVZ.A:the distribution of BrdU+cells around the lateral ventricle，bar=100 μm(a)，bar=25 μm(b，c);B:quantification of the number of BrdU+cells.图1 脑室室管膜下区BrdU免疫荧光染色

2 MG132注射后不同时点SVZ蛋白酶体活性

侧脑室注射MG1323 d、7 d、14 d后提取SVZ总蛋白，荧光酶标仪检测蛋白酶体活性，见图2。结果显示MG132注射3 d、7 d组SVZ蛋白酶体活性较DMSO对照组显著降低，分别降至0.662±0.100(P＜0.05)和0.687±0.105(P＜0.05)，提示侧脑室注射MG132短时程内(3 d、7 d)能够有效抑制SVZ蛋白酶体活性。MG132注射14 d后SVZ蛋白酶体活性较3 d、7 d显著增高(P＜0.05)，与DMSO对照组相比无明显差异(P＞0.05)，提示可逆性蛋白酶体抑制剂MG132侧脑室注射14 d后其抑制作用消失，SVZ蛋白酶体活性恢复至正常水平。

Figure2.Fold of proteasome activity after injection of MG132 or DMSO.*P ＜ 0.05 vs DMSO in the same time point;△P ＜0.05 vs 14 d.图2 MG132组和DMSO组注射后不同时点蛋白酶体活性变化

3 MG132注射后不同时点SVZ BrdU+细胞数

侧脑室注射MG1323 d、7 d后，SVZ BrdU+NSCs降至21±4(图3D')和22±3(图3E)，较 DMSO 对照组[67±8(图3A)和53±6(图3B)]明显减少(图4)，P＜0.05，提示降低SVZ蛋白酶体活性能够显著抑制NSCs增殖能力。侧脑室注射MG13214d后随SVZ蛋白酶体活性恢复BrdU+NSCs数量升至82±4(图3F)，与DMSO对照组相比(67±6)(图3C)无显著差异(图4)，P＞0.05，提示随时间延长可逆性蛋白酶体抑制剂MG132抑制作用消除，NSCs增殖能力恢复至正常水平。

讨 论

NSCs是具有自我更新能力和多向分化潜能的未分化细胞。位于SVZ的NSCs是目前公认的成年个体NSCs最为集中的地方，分裂增殖产生的祖细胞可以长距离迁移至嗅球，是研究个体发育过程中NSCs生物学特性的最佳部位[5，6]。因此，本实验选取SVZ作为目的脑区，通过 BrdU掺入实验观察NSCs增殖情况。BrdU是研究在体NSCs增殖和分化能力的一种确切可靠的标记方法，目前已被国际上广泛应用[7，8]。本实验结果显示BrdU阳性NSCs分布于侧脑室SVZ，BrdU阳性细胞着色部位为细胞核，可与细胞核特异性荧光染料DAPI重叠，证明染色结果特异性强，BrdU免疫荧光标记能够客观反映NSCs增殖情况。

Figure3.Immunofluorescent staining of BrdU in SVZ after injection of MG132 or DMSO at different time points.A:3 d DMSO group;B:7 d DMSO group;C:14 d DMSO group;D:3 d MG132 group;E:7 d MG132 group;F:14 d MG132 group.Bar=50 μm.图3 MG132组和DMSO组注射后不同时点脑室室管膜下区BrdU免疫荧光表达

Figure4.Quantification of the number of BrdU+cells after injection of MG132 or DMSO at different time points.*P＜0.05 vs DMSO at the same time point;△P ＜0.05 vs 14 d.图4 MG132组和DMSO组注射后不同时点BrdU阳性细胞数

蛋白酶体是一种高度保守的多价催化蛋白酶复合物，通过选择性降解功能蛋白，介导DNA修复、细胞周期调控、基因转录调控以及信号转导等多种生命活动[9]。应用蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体活性是目前研究蛋白酶体功能的重要手段。MG132是经典的蛋白酶体抑制剂，属醛基肽类蛋白酶体抑制剂，它通过与蛋白酶体催化中心可逆性结合，抑制蛋白酶体活性，从而阻断其对异常蛋白的降解。本实验选择侧脑室注射10 μg MG132，结果显示侧脑室注射MG1323 d、7 d后能够显著抑制SVZ蛋白酶体活性，但随注射时间延长，14 d后SVZ蛋白酶体活性恢复至正常水平，与DMSO对照组相比无明显差别，表明侧脑室注射MG132能够可逆性调节SVZ蛋白酶体活性。

近年的研究结果表明随年龄增加体内蛋白酶体活性持续降低[10]。Hwang 等[11]的研究结果显示，50岁人群蛋白酶体活性仅为20岁人群的1/2，高龄人群蛋白酶体功能亚单位合成显著减少。蛋白酶体功能异常将会导致细胞内氧化蛋白和泛素化蛋白堆积，这些结构和功能异常的蛋白产生细胞毒性作用从而引发细胞损伤。Chondrogianni等[12]应用蛋白酶体抑制剂作用于表皮成纤维细胞，细胞出现增殖能力降低、生长停滞以及凋亡迹象，细胞周期抑制因子p21、p16表达水平上调。若过表达蛋白酶体相关基因、改善蛋白酶体活性，则能增强细胞对氧化损伤的耐受力，提高细胞存活率[13]。本研究结果也证实，侧脑室注射MG1323 d、7 d后蛋白酶体活性下降，SVZ BrdU+NSCs数量显著减少;14 d后随蛋白酶体活性恢复，BrdU+NSCs数量升至正常水平，表明蛋白酶体活性与NSCs增殖能力密切相关。干细胞的自我更新、激活、增殖、分化依赖于其生存的特殊微环境，即干细胞niche。有文献报道蛋白酶体功能缺陷是帕金森、老年痴呆等神经退行性疾病的共同病因[14，15]。由此我们推测，蛋白酶体活性降低造成错误蛋白和氧化蛋白在体内蓄积[16]，破坏NSCs生存微环境，进而导致个体神经发育及再生障碍。然而，NSCs的增殖分化受多种信号通路调控，其过程错综复杂，蛋白酶体对NSCs增殖能力的调控机制尚待进一步研究。

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