柴胡总皂苷对酒精性肝病大鼠肝脏转化生长因子-β1和α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

李素婷 王宝源 杨鹤梅 齐洁敏 王 冉 (承德医学院，河北 承德 067000)

酒精性肝病(ALD)是由于长期过量饮酒导致的中毒性肝损害。据统计，约2/3的酗酒者可发展成酒精性肝病，已逐渐发展为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，是当今世界亟待解决的公共卫生问题〔1〕。开发并筛选对ALD有确切防治作用的中药新药并应用于临床，是当前面临的重要课题。柴胡为伞形科植物柴胡的根部，具有解表退热、疏肝解郁、升举阳气的功效。柴胡的主要有效成分为柴胡皂苷(SS)，具有抗炎、镇痛、降血脂等多方面药理作用〔2，3〕。本实验观察柴胡总皂苷对实验性ALD的防护作用和可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，雄性，清洁级，体重(200±21)g，北京实验动物管理中心提供。

1.1.2 药品与试剂 柴胡总皂苷(纯度为30∶1):昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配置;56度红星二锅头白酒:北京红星酿酒厂生产;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒:北京中生生物工程公司。转化生长因子-β1(TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单抗:购于武汉博士德工程有限公司。

1.1.3 主要仪器 半自动生化分析仪(MD-100):美国Bayer公司生产，721W微机型分光光度计:上海光学仪器五厂，Olympus光学显微镜和摄像显微镜:德国Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型的建立〔4〕取SD大鼠45只，随机分为3组。①酒精组(20只)，56度红星二锅头白酒用蒸馏水配制成酒精40%的白酒，按10 ml/kg每日分两次灌胃造模4 w，第5周酒精浓度升至50%，按10 ml/kg每日分2次继续灌胃4 w，并辅以高脂饲料(由颗粒料、胆固醇和猪油按79∶1∶20的比例微波炉加热制成)。②柴胡皂苷组(15只)，除每天灌胃白酒和高脂饲料外(方法同酒精组)，每天上午11点灌胃柴胡总皂苷200 mg/kg;③正常组(10只)，普通饲料通常方法喂养，自由进食、饮水，每天下午用等体积蒸馏水灌胃。各组于造模起第8周末断头处死大鼠。取血分离血清，取大鼠肝脏并称重，在肝右叶同一部位切去肝组织，生理盐水冲洗后，置10%甲醛溶液固定，24 h内制成蜡块。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 肝功能指标检测 应用半自动生化分析仪按赖氏法测定血清ALT、AST活性。

1.2.2.2 肝脏切片形态学观察 取石蜡包块进行常规切片，每张切片厚度为4 μm，作HE染色和V-G胶原纤维特殊染色，肉眼观察和光镜下观察肝组织病理改变和纤维增生和分布情况。并参照文献〔5〕制定的肝纤维化评定标准，在光镜下观察纤维化情况并进行评分。

1.2.2.3 免疫组化法检测肝组织TGF-β1和α-SMA的表达

取各组组织切片，磷酸盐缓冲液浸泡，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，采用SABC法检测TGF-β1、α-SMA在大鼠肝组织中的表达，结果判定参考文献〔6〕。

2 结果

2.1 柴胡皂苷对ALD大鼠血清ALT、AST、活性的影响 和正常组比较，酒精组大鼠血清中ALT、AST活性显著升高(P＜0.01)，而与酒精组相比，柴胡皂苷可明显降低大鼠血清中ALT、AST活性(P＜0.01)。表明柴胡皂苷能够保护大鼠肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，对酒精性肝损伤具有保护作用。见表1。

表1 柴胡皂苷对ALD大鼠血清ALT、AST活性的影响(±s)

表1 柴胡皂苷对ALD大鼠血清ALT、AST活性的影响(±s)

与正常组比较:1)P＜0.01，与模型组比较:2)P＜0.01

组别 n ALT(U/L) AST(U/L)正常组10 21.25±6.91 36.34±2.19酒精组 10 84.20±4.121) 64.32±3.411)柴胡皂苷组 10 45.37±4.542) 39.24±4.102)

2.2 肝组织病理学观察 肉眼观察:正常大鼠肝脏外观红润，表面光滑，质地较软;模型组大鼠外观呈黄褐色，表面粗糙，有许多细小结节，质地较脆;SS保护组肝脏表面稍有粗糙，质地中等，形态接近正常。HE染色:正常组肝组织结构正常，肝细胞索排列整齐，肝小叶结构完整，在肝细胞窦及汇管区有少量成纤维细胞，无肝细胞脂肪变性坏死;模型组大鼠肝组织病理损伤严重，肝小叶结构紊乱，肝细胞呈气球样变及脂肪变性，肝细胞肿胀，胞质疏松，可见较大脂滴;汇管区有炎症细胞浸润，纤维组织增生明显，胶原纤维沿汇管区及中央静脉周围向肝小叶内延伸，肝小叶失去正常的结构特点。柴胡皂苷保护组上述症状明显减轻，肝细胞有轻度空泡样变性，纤维组织增生明显减少。V-G染色:正常组结果同HE染色，无纤维化模型组汇管区可见大量胶原纤维，伸入肝小叶形成纤维间隔，肝窦内有断续状胶原纤维沉积。柴胡皂苷保护组胶原纤维增生有不同程度的改善，纤维隔明显变薄。肝纤维化积分:与模型组相比(18.48±2.42)分，柴胡皂苷保护组肝纤维化积分有明显改善〔(13.78±1.82)分，P ＜0.01〕。

2.3 肝组织TGF-β1、α-SMA的表达及量化结果 肝组织切片免疫组化染色显示:大鼠肝组织TGF-β1、α-SMA的表达以肝细胞胞浆为主，着色为黄色或棕黄色。正常组肝组织中α-SMA主要表达于汇管区动、静脉壁，而模型组α-SMA在汇管区、纤维间隔和肝血窦处均呈阳性表达;柴胡皂苷保护组α-SMA表达较模型组有明显减弱，仅在汇管区和纤维间隔内有少量阳性细胞。正常肝组织中微弱表达TGF-β1蛋白，显色很淡，模型组TGF-β1阳性信号明显增强，阳性染色分布于变性的肝细胞、纤维化区、汇管区和血管壁，柴胡皂苷保护组TGF-β1表达明显降低，结果统计学分析有显著差异(P＜0.05)。见表2。

表2 柴胡皂苷对大鼠肝组织TGF-β1及α-SMA表达量化结果的影响(±s)

表2 柴胡皂苷对大鼠肝组织TGF-β1及α-SMA表达量化结果的影响(±s)

与模型组比较:1)P＜0.05

组别 n TGF-β1 α-SMA正常组组10 0 0模型组 12 6.88±1.42 6.26±2.14柴胡皂昔组 12 4.62±1.821) 3.78±1.621)

3 讨论

肝纤维化的形成是肝细胞的慢性损伤、炎症和不断的组织重建，造成大量细胞外基质(ECM)在肝脏广泛沉积的病理过程。虽然多种细胞均能合成ECM，但肝星状细胞(HSC)是肝纤维化中ECM的主要来源和肝纤维化过程起主要作用的细胞。各种致病因素造成肝损伤时，肝枯否细胞、窦内皮细胞以及坏死的肝细胞等分泌多种细胞因子如TGF-β1、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)等，随同血小板、肝窦内皮细胞等分泌多种细胞因子，共同作用于肝HSC，其结果是HSC发生基因表达和表型改变，表现为转录活化、信号分子活化及诱导早期结构基因表达，使其细胞膜上表达多种细胞因子(如PDGF、TGF-β1)受体，对细胞因子产生应答，增殖并转化为肌成纤维细胞，表达α-SMA，具有收缩性、炎症性和高增殖性，并合成大量的ECM在肝脏沉积〔7〕。因此，检测α-SMA在肝脏的过度表达是判断HSC活化的标志。目前研究表明，转化生长因子β1是促肝纤维化最强的细胞因子，活化的HSC是TGF-β1的主要来源〔8〕。肝损伤时，HSC、枯否细胞及其他细胞通过自分泌或旁分泌方式产生大量TGF-β1，TGF-β1通过自身调节机制，刺激上述细胞产生更多的TGF-β1，形成级联放大效应，导致TGFβ1的大量生成和激活。激活的TGF-β1与细胞膜上的相应受体结合，使受体活化并作用于特异的受体蛋白向细胞内传递信号，调节靶基因表达。主要表现为:刺激肝HSC活化和向肌成纤维细胞转化;诱导基质基因的表达;抑制细胞外基质的降解〔9〕。因此，抑制肝组织TGF-β1的表达和HSC的活化，是对酒精性肝损伤保护作用的重要环节。本研究结果显示SS对酒精性肝病有明显的预防作用，其机制可能是:保护肝细胞的结构和功能，抑制TGF-β1信号传导对肝星形细胞的活化，减少细胞外基质的大量分泌和异常沉积。

1 庄 辉.酒精性肝病的流行病学〔J〕.中华肝脏病杂志，2003;1(11):698.

2 何美姗，孙小玉.正柴胡饮颗粒的解热及抗过敏作用〔J〕.中成药，2002;24(8):284-5.

3 于庆海.柴胡皂苷的抗炎作用初探〔J〕.沈阳药学院学报，1986;3(1):14-6.

4 李舒丹，厉有名，虞朝辉.大鼠慢性酒精性肝损伤模型的建立〔J〕.浙江医学，2002;24(9):524-6.

5 王泰龄，刘 霞，周元平，等.慢性肝炎炎症活动度及肝纤维化程度记分方案〔J〕.中华肝脏杂志，1998;6(4):195-6.

6 欧阳灿辉，朱 萱，张琨和，等.熊果酸对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β2和α-SMA表达的影响〔J〕.世界华人消化杂志，2009;17(22):2237-43.

7 张春燕.肝星形细胞的活化对肝纤维化形成的影响〔J〕.当代医学，2007;131(12):170-2.

8 Gressner AM，Weiskirchen R.Modem pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF beta as major players and therapeutic targets〔J〕.Cell Mol Med，2006;10(1):76-99.

9 韦燕飞，彭 岳，谢海源，等.基于肝星状细胞分子机制的抗肝纤维化研究进展〔J〕.世界华人消化杂志，2009;17(17):1745-8.