乙醇对简单节杆菌TCCC 11037生长和细胞性质的影响

王建锋，骆健美，宋 妍，刘 洋，郑 宇，王 敏

(天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

甾体的C1，2位脱氢是糖皮质激素合成过程中的一个关键步骤。通常甾体脱氢衍生物在生理活性上要强于其前体，具有更好的抗炎和抗过敏活性，且副作用更小。自然界中许多微生物都具有C1，2位脱氢能力，其中简单节杆菌(Arthrobactersimplex)以专一性高等优点成为研究和应用广泛的菌株[1，2]。简单节杆菌的转化过程中需要加入有机溶剂以增加底物的溶解度，促进酶和底物的充分接触，从而提高反应效率。目前，乙醇以其毒性低、污染小、成本低廉等优点在工业生产中广泛使用[3]。

目前，简单节杆菌C1，2位脱氢反应的研究多集中在有机溶剂的选择[4]、工艺条件的优化[5]和脱氢动力学研究[6]。2009年，别松涛等[7]以菌体的糖代谢活力保留值表征多种有机溶剂对简单节杆菌的毒性，该指标只是反映了细胞代谢活力的变化，而有机溶剂添加后对细胞性质的影响是非常复杂的[8]，需要从多方面进行考察。

作者从菌体生长、细胞形态、耗糖能力、跨膜电位和膜通透性等方面研究乙醇对简单节杆菌TCCC 11037生长和细胞性质的影响，拟为深入了解有机溶剂对细胞生物学活性的影响提供基础数据、也为毒性机理的研究奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

简单节杆菌(Arthrobactersimplex)TCCC 11037，天津科技大学生物工程学院微生物制药研究室保存。

斜面培养基、种子培养基和菌体培养基参照文献[9]配制。

无水乙醇、甲醇，天津市立元化工有限公司；罗丹明123(Rh123)、二乙酸荧光素(FDA)，德国默克公司；其它药品均为市售分析纯。

JSPM-5200型原子力显微镜；YJ-875S型医用净化台；WS2-134-75型电热恒温培养箱；GB204型电子分析天平；Gilson微量取样器； RF-5301PC型荧光分光光度计；SBA-90型生物传感仪；UVmini-1240型紫外可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 斜面培养

30℃恒温培养1～2 d。

1.2.2 种子培养

从斜面上挑取活化后的ArthrobactersimplexTCCC 11037菌种1环，接种于装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、32℃培养18 h，此时菌体OD600为0.8。

1.2.3 菌体培养

按5%的接种量将种子液接种于装有30 mL菌体培养基的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、32℃培养。菌体培养时根据需要添加不同体积分数的乙醇。

1.2.4 乙醇体积分数对菌体生长的影响

菌体培养基中分别加入体积分数为1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接种后32℃、160 r·min-1培养32 h，每隔4 h取样。通过平板活菌计数法确定添加不同体积分数乙醇后菌体的生长量，比生长速率的计算参照文献[10]。其中，未添加乙醇的菌体培养基作为对照，每个实验3个平行样。

1.2.5 乙醇体积分数对细胞超显微结构的影响

菌体培养基中分别加入体积分数为0%、2%、5%、8%的乙醇，接种后于32℃、160 r·min-1培养24 h。5000 r·min-1离心收集菌体，并用无菌水洗涤2次，将细胞于2.0%戊二醛溶液中固定，4℃冰箱内过夜。将细胞浓度调至相同(OD600为0.6)，取少量菌悬液于盖玻片上，晾干，原子力显微镜检测。成像在大气环境下进行，扫描模式为轻敲模式，所有图像均通过自动平滑和低通滤波处理以消除慢扫方向的低频噪音，选择5 μm视野进行观察。

1.2.6 乙醇体积分数对菌体耗糖能力的影响

菌体培养基中分别加入体积分数为1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接种后于32℃、160 r·min-1培养32 h，每隔约4 h取样1 mL，稀释20倍后用生物传感仪测定发酵液中的残糖浓度。其中，未添加乙醇的菌体培养基作为对照，每个实验3个平行样。

1.2.7 乙醇体积分数对菌体细胞膜跨膜电位和通透性的影响

菌体培养基中加入体积分数分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%的乙醇，接种后于32℃、160 r·min-1共同培养24 h，取10 mL培养液5000 r·min-1离心，生理盐水洗涤2次后重悬，将菌体的OD600值均调至0.8(此时细胞浓度约为1×107cfu·mL-1)。细胞膜跨膜电位的测定采用Rh123荧光法[11]，膜通透性的测定采用FDA荧光法[11]。其中，未添加乙醇的菌体培养基作为对照，每个实验3个平行样。

2 结果与讨论

2.1 乙醇体积分数对简单节杆菌生长的影响(图1、图2)

图1 不同乙醇体积分数下简单节杆菌TCCC 11037的生长曲线

由图1可知，在简单节杆菌TCCC 11037生长过程中，乙醇的加入对菌体生长产生一定影响。随着乙醇体积分数的增加，菌体生长的延滞期明显延长。当乙醇体积分数达到6%时，24 h的生长量与培养初期基本上一致，即仍处于延滞期。另外，乙醇体积分数对菌体生长量有明显的抑制作用，当乙醇体积分数为3%时，菌体量为1.9×109cfu·mL-1，仅为对照组的14.84%，之后继续增大乙醇体积分数到6%，菌体几乎未见明显生长。

图2 不同乙醇体积分数下简单节杆菌TCCC 11037的比生长速率

由图1和图2可知，简单节杆菌TCCC 11037的初始生长速率和比生长速率均随着乙醇体积分数的增加而下降。当添加1%乙醇时，菌体的比生长速率为0.2662 h-1，添加3%乙醇时为0.1550 h-1，分别比对照组(0.3479 h-1)下降了23.49%和55.45%；继续增大乙醇体积分数，菌体比生长速率继续下降但变化不大，维持在0.0680～0.0419 h-1的较低水平，仅为对照组的19.54%～12.04%。

2.2 乙醇体积分数对简单节杆菌超显微结构的影响(图3)

图3 不同乙醇体积分数下简单节杆菌TCCC 11037的超显微结构

由图3可知，在简单节杆菌TCCC 11037生长过程中，随着添加乙醇的体积分数逐步增大，简单节杆菌TCCC 11037的细胞形态出现较明显变化。对照菌体的细胞形状较规则，近短杆形，细胞膜光滑完整；2%乙醇组的细胞出现不规则的形状，两端有向上翘起的趋势，细胞长径减小，部分有凹陷；5%乙醇组的细胞体积明显增大，部分细胞膜出现破损，细胞表面较对照组粗糙；8%乙醇组的细胞形状极不规则，细胞发生明显的胞浆外泄，完整性受到明显破坏。

2.3 乙醇体积分数对简单节杆菌耗糖能力的影响(图4)

图4 不同乙醇体积分数下简单节杆菌TCCC 11037的耗糖情况

由图4可知，在简单节杆菌TCCC 11037生长过程中，乙醇的加入对菌体的耗糖能力产生了一定的抑制作用，耗糖速率和耗糖量随着添加的乙醇体积分数的增大均呈明显下降趋势。添加3%乙醇菌体生长到20 h和32 h时，培养液中的残糖浓度分别下降了2.5 g·L-1和4.2 g·L-1，为对照组耗糖量的37.88%和55.26%。添加6%乙醇菌体生长到20 h时，菌体的耗糖量仅为0.3 g·L-1，延长培养至32 h，菌体的耗糖量仍维持在较低水平，仅为0.7 g·L-1，是对照组耗糖量的9.21%，说明添加6%乙醇时菌体耗糖能力几乎完全受到抑制。

2.4 乙醇体积分数对简单节杆菌跨膜电位和通透性的影响(图5)

图5 乙醇体积分数对简单节杆菌TCCC 11037跨膜电位和通透性的影响

由图5可知，在简单节杆菌TCCC 11037生长过程中，菌体的跨膜电位随着乙醇体积分数的增大表现出下降的趋势，当乙醇体积分数为3%时，Rh123荧光强度为对照组的85.86%，当乙醇体积分数继续增大到6%时，仅为对照组的75.42%。一般认为，菌体跨膜电位的下降说明细胞自身生命活力的减弱[12]。由图3可知，这种细胞活力的减弱可能是因为高体积分数乙醇存在下细胞完整性受到破坏，胞浆大量外泄造成的。

细胞膜的通透性随着乙醇体积分数的增大表现出增大的趋势，当乙醇体积分数为3%时，FDA荧光强度为对照组的106.58%；当乙醇体积分数继续增大到6%时，为对照组的118.37%。这说明随着乙醇体积分数的增大，细胞膜的通透性增大，有机溶剂在细胞膜内积累浓度的增大是抑制菌体生长和细胞活力的重要原因[8]。

3 结论

(1)考察了乙醇体积分数对简单节杆菌TCCC 11037生长的影响。结果发现，乙醇对菌体生长产生抑制作用。随着乙醇体积分数由1%逐步递增到6%，菌体延滞期相应不断延长，菌体生物量和菌体的比生长速率呈逐步下降趋势。当乙醇体积分数为3%时，简单节杆菌TCCC 11037的延滞期延长到了16 h，生长量为对照组的14.84%，比生长速率下降为对照组的44.55%。当乙醇体积分数为6%时，几乎观察不到明显的菌体生长。

(2)考察了乙醇体积分数对简单节杆菌TCCC 11037细胞完整性的影响。原子力显微镜观察发现，对照组的细胞形状较规则，近短杆形，细胞膜光滑完整。实验组菌体主要呈短杆状和球状，细胞形状不规则，细胞表面不平整，菌体形态随着乙醇体积分数的增大出现显著改变，当乙醇体积分数为8%时，出现了明显的细胞破损和胞浆外泄，细胞完整性明显破坏。

(3)考察了乙醇体积分数对简单节杆菌TCCC 11037的耗糖能力、跨膜电位和通透性的影响。结果发现，随着乙醇体积分数的增大，菌体的耗糖能力受到抑制，菌体生长到32 h时，对照组和3%乙醇添加组中的葡萄糖浓度由9.8 g·L-1分别下降到2.2 g·L-1和5.6 g·L-1，在6%乙醇下，培养基中的葡萄糖几乎没有明显消耗。利用Rh123法和FDA法分别考察了乙醇体积分数对菌体跨膜电位和通透性的影响，结果表明，随着乙醇体积分数的增大，跨膜电位下降，细胞膜通透性增大。当乙醇体积分数为3%时，跨膜电位下降14.14%，细胞膜通透性增加6.58%；当乙醇体积分数为6%时，跨膜电位下降24.58%，细胞膜通透性增加18.37%。

[1]王普，岑沛霖，陈希杨.简单节杆菌催化17α-羟基-16β-甲基-孕甾-4，9(11)-二烯-3，20-二酮脱氢酶产酶条件研究[J].中国现代应用药学杂志，2005，22(3)：194-198.

[2]叶丽，史济平.甾体微生物转化在制药工业中的应用[J]．工业微生物，2001，31(4)：40-48.

[3]李福，王普，李荣贵.有机溶剂/水两液相体系中甾体激素的生物转化[J].生物技术，2004，14(3)：76-78.

[4]马书章，别松涛，张一，等.促溶剂对生物催化甲基睾丸素C1，2位脱氢的影响[J].药物生物技术，2007，14(4)：273-276.

[5]葛翔，龚万本，王海清，等.6α-甲基可的松C1，2微生物脱氢反应的研究[J].化学反应工程与工艺，2006，22(4)：344-349.

[6]龚万本，关怡新，王海清.简单节杆菌催化6-甲基醋酸可的松C1，2脱氢动力学[J].高校化学工程学报，2007，21(6)：983-988.

[7]别松涛，王珊，蒋彦洁，等.简单节杆菌AS1.94＊细胞对有机溶剂的耐受性[J].中国酿造，2009，(7)：28-32.

[8]王庆利，何丹，郑晓冬，等.有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制[J].微生物学通报，2002，29(4)：81-85.

[9]Zhang L T，Wang M，Shen Y B，et al.Improvement of steroid biotransformation with hydroxypropyl-β-cyclodextrin induced complexation[J].Appl Biochem Biotechnol，2009,159(3)：642-654.

[10]Eileen M E，Phillip C W，Mark T B.The effect of high concentration isopropanol on the growth of a solvent-tolerant strain ofChlorellavulgaris[J].Enzyme and Microbial Technology，2004，35(2-3)：140-146.

[11]卢群，丘泰球，杨红.Rh123、FDA荧光法测定超声作用对大肠杆菌细胞膜的影响[J].广东药学院学报，2006，22(2)：179-184.

[12]Sikkema J，de Bont J A M，Poolman B.Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，1995，59(2)：201-222.