微生物碳酸酐酶在矿化沉积中的研究进展

张小菊，杨 娟，李横江

(华中科技大学武昌分校城市建设学院，湖北 武汉 430064)

碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)是生物体内普遍存在的一种金属酶，其活性中心中含有一个催化活性所必需的锌原子，催化CO2进行可逆水合反应，在矿化沉积中扮演着重要的角色[1，2]。

生物矿化沉积是一种广泛而复杂的固液之间、有机物和无机物之间的物理化学过程，是以少量有机质为模板，进行分子操作，高度有序地组合成无机材料，构成矿物质点的形态大小、空间排列、结晶取向和同质多晶类型[3]。目前石质文物的人为破坏作用、微生物破坏作用、风化作用严重，对石质文物进行保护的研究主要集中在石质文物微生物的腐蚀机理[4]、石质文物的防风化、利用生物矿化的原理在石材表面仿生合成保护材料[5～7]等。已有研究微生物诱导的矿化作用对碳酸钙形成的影响及遗产保护的相关报道[8～10]，但利用生物的矿化沉积特别是碳酸酐酶的作用来修复石质文物还研究得较少。

作者主要综述了微生物碳酸酐酶在矿化沉积中的研究进展及在环境生物修复、石刻文物保护中的应用价值，并对其研究进行了展望。

1 微生物碳酸酐酶在矿化沉积中的研究现状

有关植物碳酸酐酶、微生物碳酸酐酶的研究报道均较多，探讨了碳酸酐酶在岩溶环境中的分布、活性、稳定性、与生态系统元素迁移之间的关系等[11～13]。研究表明，植物的根系、土壤中的微生物等都是碳酸酐酶的重要来源，其活性与地球化学环境等关联性强[14]。

目前，有关微生物碳酸酐酶引起的矿化沉积作用还研究得较少。因微生物碳酸酐酶催化的是CO2的可逆水合反应，反应生成的H+会影响CaCO3的电离平衡，反应式如下：

(1)

由此可知，研究碳酸酐酶在钙化沉积中的作用，对环境修复或制备碳酸盐晶体等有重要意义。

有关碳酸酐酶与钙化沉积的关系早在十几年前就有研究，主要集中在海洋生物的钙化沉积等方面。

Miyamoto等[15]首次报道在牡蛎珍珠层的一种可溶性有机基质蛋白质中发现了2个功能域：一个是CA，一个是 Gly-Xaa-Asn(Xaa=Asp或 Glu)重复域。CA域被Gly-Xaa-Asn重复域插入分成2个子域，其重复的Gly-Xaa-Asn域可能连接钙，同时碳酸酐酶由于催化上述反应而参与了珍珠层 CaCO3晶体的形成。

Watanabe等[16]从珊瑚的外骨骼化钙化组织中提取生物的有机基质，从中分离出46 kDa的蛋白质，对其氨基酸序列进行分析，发现该蛋白质的内部序列与 CA的部分序列类似，进一步证实了碳酸酐酶能促进钙化沉积。

Beiner等[17]对鱼类耳石矿化形成的早期阶段碳酸酐酶所起的重要作用进行了研究，认为在耳石播种的很早阶段，CA可能有助于前体颗粒的增长过程。

Rahman等[18]研究了珊瑚内骨骼硬化组织中CA的新的活性，并研究了CA与钙化硬组织形成之间的关系，认为CA域参与了钙化过程，能控制CaCO3晶体的形貌。

珊瑚中的基质蛋白质不仅是一种结构蛋白，而且是一种催化剂，可促进钙化沉积。Rahman等[19]研究表明，酸性蛋白在控制矿物的形成和发展中发挥重要作用。鉴定不溶性有机基质中酸性蛋白及其作用对于理解珊瑚中个体蛋白的功能非常重要。分析短指多型软珊瑚(Sinularia polydactyla)的可溶性和不溶性基质层中蛋白组分表明，不溶性基质和可溶性基质层中天冬氨酸的含量分别是61%和29%。利用体外分析法发现，基质蛋白诱导碳酸钙形成非晶态析出相先于其形成钙质的结晶态。对不溶性基质组分分析显示一个分子量为109 kD的蛋白质可以与形成骨片的钙离子结合，这一过程对骨片形成非常重要。对在生物钙化过程中起重要作用的碳酸酐酶的分析表明了此酶的新的活性。以上结果表明珊瑚中不溶性基质内富含天冬氨酸的蛋白在生物矿化调控过程中起重要作用。

有关碳酸酐酶对CaCO3晶体生物沉积的调控作用也有一些研究，主要通过购买纯牛CA进行模拟实验，结果发现转换反应(2)是CaCO3晶体沉积的限速步骤，但CA的调控机理有待进一步研究。

(2)

2 微生物碳酸酐酶的应用价值

通过涂抹工艺和注入工艺的实践，可在材料表面原位矿化沉积出方解石，增强了微生物修复在实际工程中应用的可操作性。王瑞兴等[22]以琼脂作为载体，采用涂刷技术将菌株和营养物质固载于水泥石表面，创造菌株生长、酶化和碳酸钙沉积的微环境，7 d后能在水泥石表面紧密附着生成厚度100 μm左右的碳酸钙膜，同时将高浓缩菌株与砂基材拌合，并混合尿素和Ca2+，制备成浆体，注入到水泥石人造裂缝中，通过定时滴加修复营养液的方法，逐渐在裂缝砂粒之间矿化沉积出碳酸钙，最终将砂粒紧密胶结在裂缝内，达到裂缝修复的目的。

微生物碳酸酐酶促进碳酸盐沉积应用前景还体现在生物矿化的CaCO3晶体，可作为吸附材料、催化材料、陶瓷材料、敏感介质(如酶、蛋白质)保护材料、药物缓释材料等，在化工、环保、生物、医药和建材等领域有着广泛的应用前景；还可以应用于工程如混凝土微裂缝修复、古建筑表面防护处理、微纳米碳酸钙颗粒制备等；其对石质景观的保护与修复、稳固地基、预防地震、捕获放射性核素和重金属离子等作用也不容忽视。

3 微生物碳酸酐酶的研究展望

鉴于微生物碳酸酐酶在矿化沉积中的重要作用，今后的研究要致力于掌握微生物碳酸酐酶诱导碳酸盐沉积或矿化机理，明确其关键问题，如碳酸盐沉积过程中，CaCO3晶体成核、生长、结构的堆积方式、碳酸盐的大小和形态等，并掌握其调控机制；可研究来自不同有机体如植物、微生物的CA是否对CaCO3的沉积产生不同的影响；探索具有特定形态的晶体对环境污染的生物治理和修复的应用策略；以生物化学和基因工程为研究手段探讨微生物碳酸酐酶促进生物矿化的长期过程中的动力学效应、取向生长、原位合成、重要影响因素等，为石质文物表面保护和生物修复提供更多新的途径。

[1]曾宪东.植物碳酸酐酶对石灰岩岩溶的驱动作用研究[D].武汉：华中科技大学，2004.

[2]王倩，支崇远.硅藻碳酸酐酶对石灰岩岩溶的作用及其生态意义[J].上海地质，2007，(4)：25-27.

[3]姜国良，陈丽，刘云.贝壳有机基质与生物矿化[J].海洋科学，2002，26(6)：16-18.

[4]Mann S，Heywood B R，Rajam S，et al.Controlled crystallization of calcium carbonate under stearic acid monolayers[J].Nature，1988，334 (6184)：692-695.

[5]王成毓，赵敬哲，刘艳华，等.模拟生物矿化过程原位合成活性纳米碳酸钙[J].高等学校化学学报，2005，26(1)：13-15.

[6]张秉坚，周环，贺筱蓉.石质文物微生物腐蚀机理的研究[J].文物保护与考古科学，2001，13(2)：15-19.

[7]刘强，张秉坚.石质文物表面生物矿化保护材料的仿生制备[J].化学学报，2006，64(15)：1601-1605.

[8]王丽琴，党高潮，梁国正.露天石质文物的风化和加固保护探讨[J].文物保护与考古科学，2004，16(4)：58-63.

[9]邵高峰.环保型石质文物防风化剂的制备及性能研究[D].北京：北京化工大学，2007.

[10]周雪莹，杜叶，连宾.不同培养条件对胶质芽孢杆菌诱导碳酸钙晶体形成的影响[J].微生物学报，2010，24(7)：26-31.

[11]李强，靳振江，孙海龙.现代藻类碳酸钙沉积试验及其同位素不平衡现象[J].中国岩溶，2005，24(4)：261-264.

[12]李沛豪，屈文俊.细菌诱导矿化保护历史建筑遗产的机理及效果[J].硅酸盐学报，2009，12(4)：482-486.

[13]曾宪东，余龙江，李为，等.西南岩溶地区黄荆叶片碳酸酐酶的稳定性[J].植物学通报，2005，22(2)：169-174.

[14]戴新宾，翟虎渠，张红生，等.土壤干旱对水稻叶片光合速率和碳酸酐酶活性的影响[J].植物生理与分子生物学学报，2000，26(2)：133-136.

[15]Miyamoto H，Miyashita T, Okushima M, et al.A carbonic anhydrase from the nacremous layer in oyster pearls[J].Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，1996，93(5)：9567-9660.

[16]Watanabe T, Fududa I, Isa Y, et al.Molecular analyses of protein components of the organic matrix in the exoskeleton of two scleractinian coral species[J].Comparative Biochemistry and Physiology.Part B：Biochemistry & Molecular Biology，2003，136，B(4)：767-774.

[17]Beiner M，Anken R.On the role of carbonic anhydrase in the early phase of fish otolith mineralization[J].Advances in Space Research，2006，38(7)：1119-1122.

[18]Rahman M A，Oomori T，Uehara T.Carbonic anhydrase in calcified endoskeleton：Novel activity in biocalcification in alcyonarian[J].Marine Biotechnology，2008，28(10)：31-38.

[19]Rahman M A, Oomori T.不溶性基质中天冬氨酸丰富的蛋白在珊瑚的钙质骨片形成中的重要作用[J].生物工程学报，2008，(12)：2127-2128.

[20]李强.水生藻类碳酸酐酶(CA)对碳酸钙沉积速率控制的试验研究[D].南宁：广西师范大学，2004.

[21]李为，刘丽萍，曹龙，等.碳酸盐生物沉积作用的研究现状与展望[J].地球科学进展，2009，24(6)：597-605.

[22]王瑞兴，钱春香.微生物沉积碳酸钙修复水泥基材料表面缺陷[J].硅酸盐学报，2008，36(4)：457-464.