口炎清颗粒指纹图谱研究*

关倩怡，黄 琳，彭 维，王德勤，苏薇薇

(1.中山大学生命科学学院，广东 广州 510275；2.广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东 广州 510515)

口炎清颗粒是由山银花、玄参、天冬、麦冬、甘草五味药组成的中药制剂(国家中药保护品种)，具有清热养阴、解毒消肿的功效，用于治疗阴虚火旺所致的口腔溃疡[1]，药效确切[2]。本研究建立了口炎清颗粒的指纹图谱，为其质量监控提供了依据，有利于确保该产品质量的稳定和均一。

1 仪器与试药

Dionex P680型高效液相色谱仪(四元梯度泵、自动进样器、ATH-585柱温箱、PDA-100检测器及Chromeleon工作站，美国戴安公司)；BP211D电子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；T660/H超声波清洗器(美国埃玛公司)。

绿原酸(批号:110753-200413)、咖啡酸(批号:110885-200102)、木犀草苷(批号:111720-200602)、哈巴俄苷(批号:111730-200604)、肉桂酸(批号:110786-200503)、甘草酸铵(批号:110731-200614)、甘草苷(批号:110610-200604)等对照品，均购自中国药品生物制品检定所；口炎清颗粒及其半成品由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。

乙腈 (美国Burdick & Jackson) 为色谱纯；甲醇(广东光华化学厂有限公司)、甲酸(天津市富宇精细化工有限公司)均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷、甘草酸铵对照品约2 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成每mL含绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷、甘草酸铵各0.2 mg的对照品溶液。

2.1.2 成品供试品溶液的制备 取口炎清颗粒10袋，研细，取约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率360 W，频率35 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，减压回收溶剂至干，残渣加水约5 mL溶解，定量转移至固相萃取小柱(填料：C18，规格：6 mL,500 mg)，加水15 mL分次淋洗，淋洗液弃去，再用甲醇15 mL分次洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣定量加入甲醇2 mL，使完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液。

2.1.3 药材供试品溶液的制备 分别取药材粗粉，山银花1 g、玄参0.8 g、甘草0.5 g，精密称定，分别置于圆底烧瓶中，加入φ=50 %乙醇50 mL，回流提取2 h，滤过，滤液减压浓缩至干，残渣加水约5 mL溶解，定量转移至SPE固相萃取小柱(填料：C18，规格：6 mL,500 mg)，加水15 mL分次淋洗，淋洗液弃去，再用甲醇15 mL分次洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣用少量甲醇溶解，定容至10 mL，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为药材供试品溶液。

2.1.4 阴性供试品溶液的制备 分别取缺山银花、缺玄参、缺甘草的阴性样品适量，按“2.1.2 成品供试品溶液的制备”的方法操作。

2.2 色谱条件

Dikma PLATISIL ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以φ=0.1%甲酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0～15 min，B(98→90)；15～120 min，B(90→59)；120～125 min，B(59→59)；流速：0.8 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃。理论塔板数以绿原酸计算不低于4 000。

3 方法学考察

3.1 精密度试验

按“成品供试品溶液的制备”方法制备口炎清颗粒供试品溶液，连续进样6次，记录HPLC色谱图，以保留时间28 min峰面积较大、较稳定的2号色谱峰(绿原酸)作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD为0.05 %～0.20%,相对峰面积的RSD为0.48 %～1.78 %；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，相似度大于0.999，表明精密度好。

3.2 稳定性考察

按“供试品溶液的制备”方法制备口炎清颗粒供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24、48 h进样分析，记录HPLC色谱图，以绿原酸色谱峰作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD为0.05 %～0.44 %,相对峰面积的RSD为0.38 %～1.93 %；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，相似度大于0.999，表明供试品溶液在放置48 h内稳定性良好。

3.3 重复性试验

取同一批口炎清颗粒，按“成品供试品溶液的制备”方法平行操作，制备6份口炎清颗粒供试品溶液，分别进样分析，记录HPLC色谱图，以绿原酸色谱峰作为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果相对保留时间的RSD为0.09 %～0.34 %,相对峰面积的RSD为0.19 %～2.04 %；采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，相似度大于0.980，表明重复性好。

4 口炎清颗粒指纹图谱的构建及相关技术参数

4.1 指纹图谱的构建

取10个批号的口炎清颗粒供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图，见图1。10批口炎清颗粒共检测到 23个共有特征峰，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版》对10批口炎清颗粒高效液相指纹图谱进行评价，获得共有模式(参照指纹图谱)见图2。

图1 10批口炎清颗粒HPLC指纹图谱

图2 口炎清颗粒HPLC参照指纹图谱

4.2 10批口炎清颗粒指纹图谱比较

10批口炎清颗粒相似度系数均大于0.90，证明口炎清颗粒的生产工艺稳定，产品的均一性较好。

4.3 共有峰的标定及归属

分别精密吸取药材及阴性供试品溶液，注入液相色谱仪，采集色谱图。通过保留时间及PDA光谱对比，确定口炎清颗粒23个共有特征峰中，归属于山银花的色谱峰应有12个，归属于玄参的色谱峰有4个，归属于甘草的色谱峰应有8个，其中18号峰为玄参与甘草共有，见图3～5。取对照品溶液 ,按“2.2”项下色谱条件，进样分析，根据保留时间定性，采用PDA光谱对比，确定2、4、7、9、18、19、23号峰分别为绿原酸、咖啡酸、甘草酸铵、木犀草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草苷，结果见图6。

图3 口炎清颗粒指纹图谱、山银花药材色谱图及缺山银花阴性色谱图

图4 口炎清颗粒指纹图谱、玄参药材色谱图及缺玄参阴性色谱图

图5 口炎清颗粒指纹图谱、甘草药材色谱图及缺甘草阴性色谱图

图6 口炎清颗粒指纹图谱及混合对照品色谱图

5 讨 论

1) 口炎清颗粒含有机酸、环烯醚萜、多羟基黄酮等成分[3-5]，这些成分易溶于水，在色谱柱上不被保留，导致出峰时间太快。因此，选择流动相时，在水相中加入φ=0.1%甲酸，可有效控制出峰时间，使指纹图谱各色谱峰分离效果良好。

2) 采用二极管阵列检测器 (PDA)，考察了200～400 nm范围波长的图谱，分别在波长254、278、290、355、208 nm测试样品[6-8]，254 nm能涵盖绝大多数的峰，基线平稳，分离度良好。虽然绿原酸、咖啡酸、甘草苷在此紫外吸收较低，但其在口炎清颗粒中的含量大，仍能被检出，最终综合考虑选用254 nm作为检测波长。

3) 通过对照品加入法及PDA光谱定性，分别确证了绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、哈巴俄苷、肉桂酸、甘草酸铵、甘草苷7个已知成分的色谱峰。本研究构建的指纹图谱，操作简便，专属性强、重复性好，为该产品的质量监控提供了有效手段，有利于确保产品质量的稳定、均一。

参考文献：

[1] 中华人民共和国药典委员会.中国药典:一部[M].北京:化学工业出版社,2005:334.

[2] 李忠思，张小娜，梁永,等.口炎清药效学研究.中药新药与临床药理, 1999, 10(4):216-217.

[3] 柴兴云, 李萍, 唐力英.山银花化学成分研究[J].中国中药杂志,2004, 29(9):865-866.

[4] 赵国玲,刘佳佳,林丹,等.金银花化学成分及药理研究进展[J].中成药，2002,24(12):973-976.

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[6] 张宇平,黄可龙.高效液相色谱法同时测定金银花中5种有机酸[J]. 分析试验室,2007,26(7):68-69.

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[8] 吴昭晖,罗佳波,游文玮.甘草药材HPLC 指纹图谱研究[J].中草药,2005,36(12):1868-1872.