重组人胰岛素样生长因子-1对db/db小鼠应激性血糖升高的保护作用*

孔繁强 周树民 赵荣兰 孙 蓓 梁东春

机体在遭受感染、创伤等应激作用时会出现糖代谢改变，若糖的生成率超过清除率则会出现应激性高血糖。持续的高血糖可导致高渗血症、代谢性酸中毒和组织细胞损伤。应激期间血糖控制的好坏是评价糖尿病预后的一个重要指标[1]。对于应激性高血糖，临床上常采用强化胰岛素治疗的方案，效果较好[2]。但对于伴有胰岛素抵抗（insulin resis⁃tance，IR）的糖尿病患者，强化胰岛素治疗却收效甚微。研究表明，胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）-1对糖尿病特别是IR糖尿病患者具有较好的治疗作用[3]。本文旨在研究重组人IGF（rhIGF）-1对2型糖尿病（T2DM）伴IR小鼠应激性血糖升高的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 瘦素受体基因缺陷的db/db小鼠（n=30）及同品系的正常小鼠（n=15）均购自南京大学动物中心；rhIGF-1为本实验室自行制备[4]；SYBR green Real-time PCR试剂盒和TaqDNA聚合酶为大连宝生物公司产品；兔抗小鼠葡萄糖转运酶（GLUT）4多克隆抗体及HRP标记的上样抗兔IgG购自北京中杉生物技术有限公司；小鼠胰岛素测定试剂盒购自瑞典Mercodia公司；小鼠IGF-1测定试剂盒购自美国Antigenix公司。

1.2 方法

1.2.1 db/db小鼠血糖及血胰岛素水平的监测 自6周龄后，每隔3 d随机抽取db/db小鼠及正常对照小鼠各6只,内眦静脉取血,EDTA抗凝，葡萄糖氧化酶法测定血糖，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆胰岛素及血浆IGF-1水平。当抽检的db/db小鼠表现出明显的高血糖及高胰岛素血症后，测定全部小鼠的血糖、血浆胰岛素及IGF-1水平，筛选出血糖升高显著、胰岛素抵抗明显的db/db小鼠18只用于此后的应激实验。

1.2.2 应激性高血糖的诱发 选取入选实验的db/db小鼠及正常小鼠各6只，放入22 cm×20 cm×20 cm的笼内，笼底由细铜栅构成，通过铜栅给予小鼠足底电脉冲刺激。脉冲频率及强度由电脑控制，每2~10 s间随机发生1次，电压50 V，每次持续50 ms，共刺激5 min。刺激前及刺激后每30 min尾静脉放血，以美国Therasense公司微型血糖仪及血糖试纸测定血糖1次，观察应激性高血糖的发生及持续时间。同时测定未经电脉冲刺激的db/db小鼠（n=6）及正常小鼠（n=6）的血糖作为对照。4组小鼠分别命名为正常对照小鼠（NC），电刺激的正常小鼠（NS），db/db对照小鼠（DC），电刺激的db/db小鼠（DS）。

1.2.3 应激性高血糖的干预 （1）实验动物分组：将上述18只入选实验的db/db小鼠测量血糖后，随机分为3组。A组（db/db对照组，n=6），颈背部皮下注射等体积溶媒（盐酸酸化生理盐水，pH 5.2）；B组（胰岛素治疗组，n=6），颈背部皮下注射胰岛素0.45 IU/kg；C组（rhIGF-1治疗组，n=6），颈背部皮下注射rhIGF-1 600 μg/kg。D组（正常对照组，n=6），同品系的正常小鼠，颈背部皮下注射等体积溶媒。（2）干预方式：尾静脉取血测定每只小鼠应激前血糖，随即进行电脉冲刺激，刺激结束后立即进行上述不同方式的干预，此后每30 min测定血糖1次，共测定3 h。

1.2.4 Real time-PCR检测骨骼细胞中GLUT4基因表达水平 干 预结束后立即处死各组小鼠，剪取适量骨骼肌组织置于冻存管内，-80℃低温保存。取0.5g冻存的骨骼肌组织置于1 mL Trizol试剂中，提取组织总RNA。取1.0 μg总RNA逆转录合成cDNA。以管家基因β-actin为内参照，采用SYBR green Real time-PCR试剂盒检测GluT4基因cDNA。小鼠β-actin基因的扩增引物为：上游5′-AGGGTGTGATGGT GGGAATG-3′，下游5′-CTCATTGTAGAAGGTGTGGTGC-3′；PCR产物大小为158 bp。小鼠GluT4基因的扩增引物为：上游5′-CAGAGCTA CAATGCAACG-3′，下 游 5 ′-GCCAATGAGAAAGGAAGAG-3′ ；PCR产物大小为141 bp。PCR反应在Roche LightCyler定量PCR仪上完成，反应条件为95℃预变性15 s，95℃5 s，55℃20 s，72 ℃ 1 0 s，45个循环。靶基因cDNA相对含量以2-ΔCt表示。

1.2.5 Western blot检测细胞膜中GLUT4 取0.5 g冷冻保存的骨骼肌组织置于1.5 mL RIPA裂解液中充分匀浆，1 000×g离心10 min。取上清液于40 000×g离心1 h，以0.5 mL含1%TritonX-100的PBS溶液悬浮沉淀，20%能量输出条件下超声破碎3次，每次30 s，间隔3 min。再次40 000 ×g离心1 h，上清液中含有细胞膜蛋白。BCA法测定膜蛋白样本的总蛋白质浓度，取50 μg膜蛋白行SDS-PAGE，半干法转膜，4%脱脂奶粉对NC膜进行封闭，以兔抗小鼠GLUT4多克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗与膜进行温浴。将膜于发光底物溶液中浸泡4 min后对X线胶片进行曝光，随后对胶片进行显影及定影。

1.3 统计学分析 所 有数据均经SPSS 17.0统计软件处理,实验结果以x ±s表示。重复测量资料采用重复测量方差分析，2组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 db/db小鼠相关指标的检测 与同品系的正常小鼠相比，db/db小鼠在生后8周表现出肥胖、高血糖及明显的IR症状，血IGF-1水平也明显低于正常对照组，见图1、表1。

表1 8周龄db/db小鼠及正常对照小鼠的部分指标比较（n=6，±s）

表1 8周龄db/db小鼠及正常对照小鼠的部分指标比较（n=6，±s）

**P<0.01

?

2.2 电脉冲刺激对血糖的影响 电脉冲刺激后，组间血糖水平的差异有统计学意义（F组间=48.915，P<0.05），组内不同时间点血糖水平差异无统计学意义（F时间=1.295，P>0.05），组间和时间无交互效应（F交互=1.046，P>0.05）。电刺激不同时间时，NC组和NS组差异均无统计学意义（P>0.05）；DS组和NC、NS、DC组相比，在不同时间点差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.001），见表2。

表2 电脉冲刺激对血糖水平的影响（n=6，mmol/L，±s）

表2 电脉冲刺激对血糖水平的影响（n=6，mmol/L，±s）

**P<0.01

组别NC组（1）NS组（2）DC组（3）DS组（4）F P（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（2）∶（3）（2）∶（4）（3）∶（4）30 min 6.2±1.1 9.2±3.4 10.3±2.2 17.4±4.8 13.173**0.118 0.036<0.001 0.546<0.001<0.001 60 min 5.8±1.3 6.3±1.8 9.5±4.2 18.4±6.8 11.805**0.832 0.139<0.001 0.200<0.001<0.001 120 min 6.5±1.7 5.6±1.8 10.2±2.6 13.4±3.3 13.094**0.543 0.015<0.001<0.001<0.001 0.034 90 min 5.8±0.9 6.4±1.5 9.8±3.6 16.7±5.2 14.033**0.735 0.045<0.001 0.088<0.001<0.001

2.3 rhGF-1对应激性血糖升高的保护作用 干预后，组间血糖水平差异有统计学意义（F组间=36.947，P<0.05），不同时间点血糖水平差异有统计学意义（F时间=13.880，P<0.05），且组间和时间存在交互效应（F交互=11.769，P<0.05）。与 A组小鼠相比，rhIGF-1干预（C组）在干预60~90 min时即表现出了较明显的降血糖作用，A、B组与D相比，在不同时间点的血糖水平差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表3。

2.4 骨骼肌中GluT4基因的表达水平 db/db小鼠肌肉组织中GluT4基因的表达水平低于同品系的正常小鼠。给予外源IGF-1可显著增加GluT4基因的表达，而胰岛素则不具有此作用，见表4。

2.5 细胞膜中GLUT4的含量 所提取的膜蛋白经Western blot检测，在与GLUT4蛋白分子质量相符的位置上出现单一的曝光斑。与正常对照小鼠（D组）相比，db/db对照（A组）及胰岛素干预组（B组）细胞膜内GLUT4的含量明显降低，IGF-1干预（C组）则可使GLUT4的含量显著增加，见图2。

表3 应激前和干预后180 min血糖变化情况（n=6，mmol/L±s）

表3 应激前和干预后180 min血糖变化情况（n=6，mmol/L±s）

*P<0.05，**P<0.01

组别ABCDF P A∶B A∶C A∶D B∶C B∶D C∶D应激前9.3±3.2 8.9±2.5 9.5±2.8 5.6±1.3 3.306*0.801 0.891 0.002 0.697 0.030 0.013 30 min 16.3±3.9 15.8±4.2 12.4±1.8 9.7±3.6 4.677*0.782 0.064<0.001 0.109<0.001 0.204 60 min 17.4±2.7 17.1±3.3 10.3±2.1 6.6±1.5 27.373**0.864<0.001<0.001<0.001<0.001 0.018 90 min 14.7±4.6 13.1±2.2 9.3±3.1 6.5±1.7 8.585**0.382<0.001<0.001 0.046<0.001 0.136 120 min 11.5±2.1 10.8±2.7 9.6±3.5 6.2±1.4 5.102**0.632 0.216<0.001 0.438<0.001 0.031 150 min 10.1±2.4 9.6±3.1 9.8±2.6 5.8±1.4 4.071*0.746 0.835<0.001 0.908 0.014 0.011 180 min 8.6±2.3 9.2±1.9 8.7±3.7 5.7±1.1 2.547

表4 骨骼肌中GLUT4基因的表达水平 （±s）

表4 骨骼肌中GLUT4基因的表达水平 （±s）

**P<0.01

ABCDF 0.007±0.001 0.009±0.001 0.041±0.008 0.109±0.015 185.548**组比A∶B A∶C A∶D B∶C B∶D C∶D P 0.695<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001统计学处理组别 2-△Ct n 6666

3 讨论

无论有无糖尿病，机体在面对刺激时均可能应激性升高血糖[5]。但是糖尿病患者的应激性高血糖难于控制且持续时间长，特别是伴有IR的T2DM患者所表现出的应激性高血糖难以被大剂量的胰岛素所控制，预后较差。研究显示，IGF-1有明显的降糖作用，特别是对有IR的糖尿病患者作用明显[6]。本研究以瘦素受体基因缺陷的db/db小鼠为动物模型，模拟伴IR的T2DM病例。db/db小鼠一般在生后6~10周表现出明显的血糖升高及IR，本研究证实了db/db小鼠在生后8周发生了高胰岛素血症及高血糖。

采用胰岛素和IGF-1干预显示，对于胰岛素治疗无效的应激性高血糖，IGF-1表现出了良好治疗效果。为了探究IGF-1的降糖机制，本文研究了IGF-1对骨骼肌组织中GLUT4表达及转位的影响。GLUT4所介导的葡萄糖摄取是外周组织利用葡萄糖的主要限速步骤[7]，GLUT4可通过表达的增加向细胞膜的转位这2种途径来增加细胞对葡萄糖的摄取[8-9]。经Real time-PCR及Western blot检测证明，IGF-1不但可以显著增加db/db小鼠骨骼肌组织中GluT4基因的表达，还可增加GLUT4在细胞膜的聚集，并可能因此增加糖的摄取而降低血糖。综上，IGF-1可有效控制伴IR的T2DM产生的应激性高血糖，其机制与调节GLUT4的表达及转位有关。

[1]刘晓青，钟南山，刘思蓓，等.重症SARS患者接受临床营养支持及血糖水平胰岛素用量与结局的关系[J].中国临床营养杂志，2003,11(2):80-84.

[2]Van den Berghe G,Wouters P,Weekers F,et al.Intensive insulin therapy in critically ill patients[J].N Engl J Med,2001,345(19):1359-1367.

[3]Ranke MB.Insulin-like growth factor-I treatment of growth disor⁃ders,diabetes mellitus and insulin resistance[J].Trends Endocrinol Metab,2005,16(4):190-197.

[4]梁东春,左爱军,吴亚锋,等.重组人胰岛素样生长因子1的制备[J].天津医药,2005,33(7):434-436.

[5]Digman C,Borto D,Nasraway SA Jr.Hyperglycemia in the critically ill[J].Nutr Clin Care,2005,8(2):93-101.

[6]Mohamed-Ali V,Pinkney J.Therapeutic potential of insulin-like growth factor-1 in patients with diabetes mellitus[J].Treat Endocri⁃nol,2002,1(6):399-410.

[7]Tremblay F,Lavigne C,Jacques H,et al.Dietary cod protein re⁃stores insulin-induced activation of phosphatidylinositol 3kinase/Akt and GluT-4 translocation to the T-tubules in skeletal muscle of high-fat-fed obese rats[J].Diabetes,2003,52(1):29-37.

[8]Ikemoto T,Hosoya T,Takata K,et al.Functional role of neuroendo⁃crine-specific protein-like 1 in membrane translocation of GLUT4[J].Diabetes,2009,58(12):2802-2812.

[9]Aksentijevic D,Bhandari S,Seymour AM.Insulin resistance and al⁃tered glucose transporter 4 expression in experimental uremia[J].Kidney Int,2009,75(7):711-718.