一种改良的真菌总RNA提取方法

张 洁

（山西农业大学信息学院，山西太谷030801）

总RNA提取技术是一项分子生物学基本实验技术，目前已建立了许多RNA提取方法[1-3]。实验室小规模提取总RNA最常用的是Chomezynski等[4-5]提出的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，对大多数的动植物材料都能得到质量很好的RNA样品。但对富含多糖、糖蛋白等次生物质的材料如大部分的真菌却不适用，因为利用该方法提取的真菌RNA富含RNA酶，其会造成RNA的化学降解，会使多糖以及糖蛋白形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来[6]。

本研究对提取多糖、多酚的棉花RNA取得良好结果的CTAB酸酚法进行了改进，以棉花黄萎病菌株VD8的菌丝为材料，通过适当增加变性剂的浓度，有效地抑制RNA酶活性，用LiCl选择性沉淀RNA和醋酸钠沉淀祛除多糖，旨在为分子生物学实验的顺利进行提供便利。

1 材料和方法

1.1 实验材料

用保存在试管里的棉花黄萎病菌株VD8（由江西农业大学遗传与种质资源实验室惠赠）复壮于PDA培养基上培养5 d，将PDA培养基的黄萎病病菌菌落接种到装有已灭菌的100 mLCzapek’s液体培养基的250 mL平底烧杯中，25℃振荡培养8～10 d。然后将黄萎病菌系培养物经4层纱布过滤，用液氮速冻纱布上的菌丝，保存于-80℃冰箱中备用。

1.2 试剂

RNA 提取缓冲液：1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris·HCl（pH 值为 8.0），20 mmol/L EDTA，2%CTAB，2%PVP，2% β- 巯基乙醇；8 mol/LLiCl；异丙醇；70%乙醇；0.4 mol/L NaOH；3 mol/L NaAc（pH值为5.2）；Tris平衡酚；氯仿；氯仿∶异戊醇（体积比24∶1）溶液；DEPC处理过的水。

1.3 方法

器材处理。实验中所用的玻璃器皿与用具均需在240℃下烘烤4 h，塑料制品在37℃下0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水中浸泡12 h，然后经高温灭菌后方能使用。

（1）取1 g棉花黄萎病菌丝于研钵中，加液氮充分研磨成粉末状，然后转移到10 mL离心管中；往离心管中加入5 mL的RNA提取缓冲液，振荡混匀，65℃水浴约20 min，中途混合2～3次。（2）再加入0.6体积的氯仿，来回充分混匀，然后冰浴10 min；4℃，8 000 r/min离心20 min，将上清液转移到另一10 mL的新离心管中，再加入1/3体积的8 mol/L LiCl溶液，混合均匀，然后冰浴 4 h。（3）4℃，8 000 r/min离心 20 min，弃去上部溶液，沉淀用70%乙醇洗涤，将洗涤液转移到一2 mL离心管中，4 000 r/min离心5 min，吸去乙醇溶液，用真空泵将沉淀抽干，加2 mL的DEPC水溶解沉淀，加0.8体积的酸酚/氯仿溶液（体积比1∶1），充分混合均匀，然后室温静置5 min；4℃，12 000 r/min离心 20 min，将上清液转移到另一2 mL的新离心管中，再重复用酸酚/氯仿溶液抽提1次；上清液加0.8体积氯仿抽提1次，吸取上清液并加入1/10体积3 mol/L NaAc（pH值5.2）溶液和1体积预冷的异丙醇，-20℃放置 2 h。（4）4 ℃，12 000 r/min 离心 20 min，收集RNA沉淀，用70%乙醇洗涤RNA沉淀2次，真空干燥后再加入100 μL的DEPC水，使之充分溶解，放于-80℃冰箱备用。

1.4 电泳检测

电泳槽用0.4 mo1/LNaOH浸泡4 h以上，采用DEPC水配制的pH值为8.0的Tris-醋酸-EDTA电泳缓冲液TAE，用1%的非变性琼脂糖凝胶检测。取黄萎病菌丝RNA1 μL进行电泳检测。电压120 V，电泳15 min。

1.5 核酸-蛋白分析仪测定

提取的RNA样品取1 μL用backman DU 640 核酸 - 蛋白分析仪测定 OD230，OD260，OD280的吸光度。

2 结果与分析

2.1 RNA质量检测

提取的棉花黄萎病菌丝RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，黄萎病菌丝RNA的28 S rRNA与18 S rRNA带型整齐，基本不拖尾，而且28 S rRNA带的亮度明显高于18 S rRNA，说明RNA未发生降解，完整性较好（图1）。有少量的DNA污染时，可以用不含RNA酶的DNA酶进行降解处理[7]。

2.2 核酸-蛋白分析仪测定

提取的RNA样品用backman DU640核酸-蛋白分析仪测定 OD230，OD260，OD280的吸光度，结果表明，OD280/OD260值界于 1.8～2.1之间，OD260/OD230值为2.54，说明RNA样品中没有蛋白质和盐的污染，质量较好，完全可适合分子生物学进一步研究。

3 讨论

棉花黄萎病菌丝富含多糖和次生物质，难于提取到高质量的RNA。本实验发现，菌丝在取样过程中容易受到外源RNA酶降解，样品放长时间后提取质量会下降，这是由于菌丝培养过程中并没有RNA酶抑制剂，外源RNA酶较多，不能被消除，因此，建议样品保存时间不要过长，以免影响到RNA的提取质量。

本研究针对真菌菌丝次生物质含量高的特点，对CTAB提取RNA法进行改良。首先，将β-巯基乙醇的用量提高到2%，这样在提取过程中可以有效地抑制内源性RNA酶活性和防止酚类化合物的氧化。

研究者针对富含多糖植物组织的RNA提取，提出了利用LiCl选择性沉淀RNA[8]和醋酸钠沉淀多糖的改进方法。通过2次酸性条件下的酚/氯仿抽提，有效地去除DNA和蛋白质污染。用LiCl选择性地沉淀RNA，可以除去大部分的DNA；在有钠盐的条件下，用异丙醇选择性沉淀RNA，可以除去高含量的多糖。用LiCl选择性沉淀RNA时，建议时间不要太长，过长则大量的多糖很容易包裹RNA沉淀下来[9]。杜中军等[10]用LiCl沉淀提取芒果果肉组织RNA时，也出现了类似的结果。研究者经过几次对比，4 h就能达到沉淀RNA的效果。此外，该方法对含有多酚的组织材料提取RNA也有很好的效果[11]。用改进的CTAB酸酚法提取真菌菌丝RNA的方法操作简单、迅速，在10 h之内就能提取出RNA，其适用于含次生物质丰富的真菌RNA提取。

［1］李晶，王亦学，郑德刚，等.一种简单高效提取棉花不同组织总 RNA的方法[J].山西农业科学，2009，37（5）：17-19.

［2］刘芬，于秀梅，刘大群，等.一种植物总RNA的快速提取方法[J].华北农学报，2010，25（2）：140-144.

［3］杜道海，周志刚.缺刻缘绿藻总RNA提取方法的比较研究[J].华北农学报，2008，23（增刊）：103-106.

［4］Chomezynski P，Brar A K.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction[J].Analytical Biochemistry，1987，162：156-159.

［5］赵双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法[J].遗传，2002，24（3）：337-338.

［6］Lewinsohn E.Simple isolation of functional RNA from woody stems ofgymnosperms[J].Plant BioReptr，1994，12：20-25.

［7］韩玉杰，贾炜珑，王自霞，等.几种提取植物DNA方法的比较[J].山西农业科学，2008，36（7）：17-19.

［8］De Vries S.Isolation of total and polysomal RNA from plant tissues[J].Plant Molecular BiologyManual，1993，36：1-13.

［9］方华舟.核糖核酸干扰（RNAi）研究进展及其在植物学中的应用[J].内蒙古农业科技，2007（5）：70-74.

［10］杜中军，徐兵强.一种改进的富含多糖的芒果组织中完整总RNA提取方法[J].植物生理学通讯，2005（2）：202-204.

［11］蒋建雄，张天真.利用CTAB酸酚法提取棉花组织总RNA[J].棉花学报，2003，15（3）：166-168.