HPLC法测定康妇炎胶囊中咖啡酸含量

马文龙 王海峰 张 红 陕西杨凌示范区医院(杨凌 712100)

康妇炎胶囊由蒲公英、败酱草、薏苡仁等十三味中药组成,具有清热解毒,化瘀行滞的功效。用于月经不调、痛经、附件炎、阴道炎、子宫内膜炎及盆腔炎等妇科炎症。方中君药蒲公英,主要有效成分为咖啡酸,故以咖啡酸作为制剂质量控制的指标成分。其含量测定方法,已报道的有紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法等[1][2],其中高效液相色谱法具有专属性强、可靠、灵敏度高、干扰小等特点,可作为该制剂质量控制的指标之一。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 P200 Π高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)、UV-160A紫外可见分光光度计 (日本岛津制作所)、Kromasil C18色谱柱5 μ m 250mm× 4.6mm.(天津特纳科学仪器有限公司);甲醇为色谱纯(美国 MERCK),其余试剂均为分析纯。咖啡酸对照品购自中国药品生物制品鉴定所(批号:110885-200102供含量测定用)。

1.2 色谱条件 色谱柱:用十八烷基键合硅胶为填充剂;流动相:甲醇-磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠1.56g,加水使溶解成 1000mL,再加 1%的磷酸溶液调节 PH值至 3.8～4.0,即得)(21∶79)为流动相;检测波长:323nm,柱温:30℃。流量 1.0mL/min。此条件下咖啡酸与其它组分分离效果良好,理论塔板数为3200,故确定理论塔板数以咖啡酸峰计,不得低于3000。

1.3 溶液的制备 1.3.1 对照品溶液的制备:精密称取经五氧化二磷减压干燥 24h的咖啡酸对照品1.25mg,置 50mL容量瓶中,加 5%甲酸甲醇溶液使溶解并至刻度,摇匀,即得。

1.3.2 供试品溶液制备:咖啡酸易溶于酸性甲醇溶液中,我们采用 5%甲酸甲醇溶液超声处理的方法制备供试品溶液,我们对甲醇超声提取时间进行了考察。

考察方法:取本品 20粒,除去胶囊,研细,取 1.2g,精密称定,置 50mL具塞锥形瓶中,精密加 5%甲酸甲醇溶液 10mL,密塞,称定重量,分别超声处理(功率 250W,频率 40kHz)20min、30min、40min,取出 ,放冷,称重,用 5%甲酸甲醇溶液补足减失的重量。滤过,取续滤液,用 0.45um的微孔滤膜滤过,取续滤液,即得 1～6号供试品溶液。精密吸取 1～6号供试品溶液各 20 μL,分别注入液相色谱仪。按上述条件测定咖啡酸面积积分值,数据表明咖啡酸在超声提取 20min时提取不彻底,超声提取 30min时提取率最高,故取样品加 5%甲酸甲醇超声提取 30min,作为本品含量测定项下供试品溶液制备的最佳工艺条件。即供试品制备方法确定为:取本品 20粒,除去胶囊,研细,称取 1.2g,精密称定,置 50mL具塞锥形瓶中,精密加 5%甲酸甲醇溶液 10mL,密塞,摇匀,称定重量,超声处理(功率 250W,频率 40kHz)30min,取出 ,放冷 ,称重 ,用5%甲酸甲醇溶液补足减失的重量。滤过,取续滤液,用0.45um的微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2 方法学考察

2.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2mL、4mL、 6mL、8mL、10m L分别置 10mL容量瓶中 ,加 5%甲酸甲醇溶液至刻度,摇匀,分别作为对照品溶液 1～5,精密吸取对照品溶液 1～5各 20 μL,按照上述色谱条件测定峰面积,可见咖啡酸量在 5.00～25.00 μ g/mL之间峰面积与量呈线性关系。计算得回归方程Y=1.7359X+ 0.2005,r=0.9999。

2.2 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液 3,重复进样 5次,每次 20 μL,按上述色谱条件测定峰面积,峰面积积分值标准偏差为 2.05%。

2.3 稳定性试验 取批号为 040701的样品,照供试品制备项下的方法制备供试品溶液,分别于 0、1、2、4、8、12h精密吸取 20 μL,按上述色谱条件测定峰面积积分值,峰面积积分值标准偏差为 1.79%,表明供试品溶液在 12h内稳定。

2.4 重复性试验 取批号为 040701的同批样品5份,照供试品制备项下的方法制备供试品溶液,分别取 20 μL进样,在上述色谱条件下,分别测定,含量测定结果标准偏差为 1.33%。

2.5 回收率试验 采用加样回收法,取已知含量(0.063mg/粒)的 040701批康妇炎胶囊样品 0.6g、0.9g各 3份,精密称定,分别加入咖啡酸对照品 5%甲酸甲醇溶液 (0.046mg/mL)2mL、1mL,挥干,按正文方法测定,按下式计算回收率,结果见附表,表明本品具有良好的回收率。

附表 加样回收试验

2.6 样品测定 按正文方法分别测定不同生产批号的九批样品,九批样品的平均含量为 0.0657 mg/粒。

3 讨 论

3.1 康妇炎胶囊过去的质量控制标准中只测定芍药苷,现在在原标准增加了咖啡酸的含量测定,是由于该制剂方中君药蒲公英,主要有效成分为咖啡酸,故以咖啡酸作为制剂质量控制的指标成分之一,结合芍药苷的含量测定,能更好的控制制剂的质量。

3.2 含量测定时,在样品的正确处理决定最后的测定结果,因此我们对样品处理的关键步骤甲醇超声提取时间进行了考察,发现咖啡酸在 30min超声提取时提取效果最好。

3.3 康妇炎胶囊 040701批产品所使用的蒲公英药材咖啡酸的含量为 0.038%。康妇炎胶囊每粒含蒲公英原药材 360mg,040701批产品咖啡酸含量为 0.063mg/粒,则咖啡酸在制剂中的转移率为 46.05% ,通过对药材中有效成分转移率的测定,有利于从原药材开始对该制剂进行质量控制。

[1]陈发奎主编.常用中草药有效成分含量测定[M],北京:人民卫生出版社,1997:436.

[2]苗明山.李振国.现代实用中药质量控制技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:923.