GC-MS法同时测定生鲜乳中三聚氰胺及其类似物的研究

浙江省饲料监察所 朱聪英 应永飞 罗成江 周 炜陈慧华 韦敏珏 林仙军

三聚氰胺是一种重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺树脂，广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。2008年三鹿婴幼儿奶粉事件将三聚氰胺与食品安全，特别是乳品安全联系到了一起。三聚氰胺本身的毒性较低，而三聚氰胺与三聚氰酸同时摄入体内，就会产生很严重的后果。二者能够依靠分子结构上的羟基与氨基之间形成水合键，生成不溶于水的三聚氰胺氰尿酸盐，能在肾小管中沉淀从而形成肾结结石（Heller和 Nochetto，2008）。因此，同时检测乳品中三聚氰胺及其类似物比单纯检测三聚氰胺更有实际意义。目前国内乳品中三聚氰胺检测标准已经建立，但有关三聚氰胺及其类似物同时检测的研究较少。

目前较常见的以三聚氰胺（MEL）、三聚氰酸（CYA）、三聚氰酸一酰胺（AMD）、三聚氰酸二酰胺（AMN）为目标物，三聚氰胺检测方法主要包括酶联免疫法 （Lutter等，2011），高效液相色谱法（GB/T 22388-2008； Yu 等，2010）、 气相色谱-质谱法 （Miao等，2009）和液相色谱-串联质谱法（Anderson 和 Turnipseed，2008；Michael 等 ，2007）。本研究建立了气相色谱－质谱法 （GCMS），另外对生鲜乳中三聚氰胺及其类似物进行定性、定量检测。同时，为了提高定性和定量的准确性，实验采用13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA为内标，提高了定性和定量的准确性。并对气相色谱-质谱法的回收率和重复性进行了验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 GC6890N-5973气相色谱-质谱仪（带自动进样器）：美国安捷伦（Agilent）公司，配MSD ChemStation工作站，NIST2.0a谱库；Sigma 3 k18冷冻离心机；MS2 minishaker漩涡混匀器；METTLER AG-285电子天平；氮吹仪。

1.2 材料与试剂 三聚氰胺标准品，购自国家标准物质研究中心；三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺标准品，购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于 98.0%；内标物13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA 购自 Cambridge Isotope Laboratories Inc.，均为 100 μg/mL 标准溶液；N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA），美国SUPELCO公司提供；吡啶：色谱纯，购自国家标准物质研究中心；实验用水为milli-Q超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.3 标准溶液的配制 分别精确称取三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺各10 mg于100 mL容量瓶中，三聚氰胺、三聚氰酸用水溶解后定容，三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺用2%氨水溶液溶解后定容，为标准储备液，置于0℃冰箱中保存。分别吸取适量的各标准品储备液置于同一容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，为标准工作液，使用时用甲醇稀释至所需浓度即可。内标溶液配置成 10 μg/mL的13C3，15N3-MEL和13C3，15N3-CYA内标工作液。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：初始温度80℃保持1 min，以15℃/min的速率升温至280℃保持5.0 min；进样口温度280℃；载气（高纯氦）流速：1.0 mL/min；不分流进样，进样量1.0 μL。

1.4.2 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；离子源温度230℃；接口温度280℃；溶剂延迟时间6 min；采用选择离子监测（SIM）模式进行检测。

1.5 样品处理

1.5.1 试样提取 称取生鲜乳2.0 g（精确到0.01 g），置50 mL聚丙烯离心管中，加内标工作液100 μL；加提取液（乙腈∶水∶二乙胺=5∶4∶1，V/V/V）17.0 mL、饱和乙酸铅溶液1.0 mL，10000 r/min以上均质60 s，加盖，于超声波清洗器中超声提取20 min；取出离心管，冷却后8,000 r/min离心10min，取上清液1.5 mL至2.0 mL离心管中，14000 r/min高速离心30 min，再取上清液0.5 mL至5 mL具塞玻璃试管中，50℃氮气吹干，残余物备用。

1.5.2 试样衍生和检测 残余物中加入吡啶100 μL和衍生化试剂100 μL，加塞后于涡旋混合器充分混匀，在75℃的烘箱中恒温衍生60 min，取出后冷却，加吡啶0.3 mL溶解供GC-MS分析。另取三聚氰胺及其类似物混合标准工作液适量，加内标工作液100 μL，加空白样品提取液0.2 mL后，氮气吹干，与试样同步进行衍生化。

1.6 结果计算 以峰面积按内标法进行单点或多点校准定量，标准工作液和试样液中被测物响应值均应在仪器检测线性范围内。以13C3，15N3-CYA作为计算三聚氰酸和三聚氰酸一酰胺浓度的内标物；以13C3，15N3-MEL作为计算三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺浓度的内标物。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的确定 由于三聚氰胺及其类似物都是沸点较高的极性物质，且都含有-OH、-NH2等极性官能团结构，直接采用气相色谱进行分离较为困难。为改善各组分气相色谱性质，在进行仪器检测前必须对样品进行衍生化处理。经BSTFA衍生化后，所含氨基、羟基上的氢均可被三甲基硅烷所取代，形成含有3个硅烷基结构的衍生物（Tri-TMS），此时的色谱行为良好。衍生化后的4种化合物的质谱图和2种内标物的质谱图见图1。

图1 三聚氰胺及其类似物和内标物衍生物的质谱图（EI源）

在采用气质联用技术进行多组分残留测定时，即要充分考虑监测离子的丰度以提高灵敏度，又要考虑尽量减少样品基质和不同化合物之间的离子干扰。由质谱图可知，三聚氰胺的衍生物在m/z342，327，171，285 有特征离子，这些碎片离子的比例关系可用于三聚氰胺的定性分析。定量离子采用m/z327，此特征离子丰度最高，有助于提高检测的灵敏度，而且受杂质的干扰较少。三聚氰酸一酰胺的衍生物在 m/z344，329，171，100 有特征离子，而三聚氰酸一酰胺二酰胺的特征离子m/z343，328，171，285； 三聚氰酸的特征离子有 m/z345，330，100，346；虽然三聚氰酸 m/z147 离子的响应值较高，但由于干扰非常严重，故未采用。三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺和三聚氰酸相应的定量离子均采用基峰，分别为m/z344、343和345。

与被检测化合物相比，内标物以定量为主，为了提高检测的灵敏度，内标物可以选择两个监测离子，以尽可能消除对被检测化合物的干扰。13C3，15N3-MEL 的监测离子为 m/z348，333，定量离子为 348。13C3，15N3-CYA的 监测 离子 为m/z351，336，定量离子为351。由于6种化合物的选择监测离子较多，同时监测这6种化合物的所有离子，势必影响仪器对单个离子的采集速率，从而降低检测方法的灵敏度。根据部分化合物之间色谱保留时间相差较大的特点，可以将监测离子分组进行扫描监测，以提高检测的灵敏度。4种三聚氰胺及其类似物和内标物的保留时间和质谱条件，见表1。

表1 三聚氰胺及其类似物和内标物的保留时间和质谱条件

2.2 气相色谱条件的确定

2.2.1 色谱柱的选择 测定TMS衍生化后的三聚氰胺及其类似物一般采用HP-5MS或HP-1MS等非极性或弱极性的毛细管柱。实验先后用（1）HP-5MS，30 m×0.25 mm ×0.25 μm 柱 ； （2）HP-1MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm 柱进行实验。 实验按不同的色谱柱采用各自最优化的分离条件，对色谱分离条件进行比较，发现（1）柱的分离效果更佳，各组分都得到了完全分离。因此，最后选用HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm 柱。

2.2.2 柱温的选择 为了提高检测的灵敏度，需对被测组分进行有效分离，从而实现分段采集。经过实验，优化柱温和程序升温速率等参数，最后确定升温程序为：初始温度80℃保持1 min，以15℃/min的速率升温至 280℃保持5.0 min；在此条件下，可使4种物质在一次分析中全部分离，可以实现分段采集，见图2。

图2 三聚氰胺类似物标准品（1）、加样标样品（2）、空白样品（3）的衍生物总离子流图

2.3 净化条件的确定 目前，为了避免三聚氰胺和三聚氰酸的氨基与羟基之间发生聚合反应，形成不溶解的水合物，生鲜乳中三聚氰胺及其类似物测定普遍在酸性或碱性溶液条件下，由水相和乙腈等组成混合提取剂，水相主要包括三氯乙酸溶液、乙酸铅溶液和二乙胺溶液等。乙腈具有一定的沉淀蛋白质作用，可以除去样品中的部分蛋白质，但从实验结果来看，当乙腈相含量过高时，三聚氰酸和三聚氰胺往往容易形成网状聚合物而沉淀，从而降低提取效果并最终影响的回收率和稳定性。20%二乙胺/乙腈、2%三氯乙酸/乙腈、2.2%乙酸铅/乙腈和乙腈水溶液等提取剂的提取效果进行了对比，结果表明，在酸性或碱性条件下均有较好的回收率，而乙酸铅沉淀蛋白时效果最佳，因此，选用20%二乙胺/乙腈为提取剂，通过对提取液比例的优化，最终选择20%二乙胺/乙腈比例为1∶1(V/V)，并采用1 mL饱和乙酸铅溶液沉淀蛋白质。

2.4 衍生化 目前，常用的TMS衍生化试剂有N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺和N，O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷（TMCS）（99∶1，V/V），通过比较，两者之间的差别不大，而BSTFA更为常用且便宜，所以采用BSTFA为衍生化试剂。对衍生温度和时间进行优化后，最后采用75℃恒温衍生60 min。

2.5 方法线性方程和检出限 取适量标准工作液和内标工作液，配置成三聚氰胺及其类似物上机液浓度为20～1000 ng/mL水平进行测定，内标物的浓度为 100 ng/mL， 以13C3，15N3-CYA（m/z 351）计算 CYA（m/z 345）和 AMD（m/z 344）的浓度，以13C3，15N3-MEL（m/z 348）计算三聚氰胺（m/z 342）和三聚氰酸二酰胺（m/z 343）的浓度。以所得峰面积的比值与被检化合物的浓度绘制标准曲线和回归方程，结果表明所得的相关系数均在0.999以上。以3倍信噪比确定方法检出限，以10倍信噪比确定方法定量限。采用空白基质添加被测物的方法进行计算，方法标准曲线和检出限见表2。

表2 三聚氰胺及其类似物的线性方程、相关系数和检出限(n=6)

2.6 回收率实验 采用本研究建立的实验方法，对添加了 0.5、1.0、5.0、50.0 mg/kg 等不同浓度三聚氰胺及其类似物的生鲜乳中进行重复性实验。每个浓度取5份平行样品，同时进行空白试样，根据上述方法进行提取、净化和测定，以内标法计算方法的回收率，并计算批内相对标准偏差。方法回收率、精密度和定量限见表3。

表3 生鲜乳中三聚氰胺及其类似物的添加回收率和精密度

以上结果表明，采用本方法检测生鲜乳中的三聚氰胺及其类似物，添加浓度为0.50～50 mg/kg时，方法的回收率为62.0%～110.0%，各样品平行间的变异系数为2.4%～13.9%，定性能满足规定的要求，说明本方法的重复性好，同时各浓度样品峰的分离度也很理想。

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