正常人肠道不同乳酸杆菌菌种耐药性的研究

熊鹿言，唐海丰，余 倩

(1.上海市普陀区疾病预防控制中心，上海 200333；2.四川大学公共卫生学院医检教研室，四川 成都 610041)

乳酸杆菌(Lactobacillus)是人体肠道常见的益生菌之一，能帮助改善、调节人体肠道微生物菌群的平衡，降低胆固醇水平。目前，从国内外对其在分子生物学水平的研究的情况来看，乳酸杆菌的质粒上携带着多种耐药基因，使其与临床常见致病菌一样，成为一个耐药基因库。部分学者认为乳酸杆菌具有耐药性是有利的，这个性质可以避免这些对人体有益的乳酸杆菌在人们利用抗生素治疗疾病的时候被一并杀灭掉。但是，这也意味着存在将这种耐药性传递给外源致病菌的巨大风险，这将对临床用药带来巨大的挑战。本研究对不同种的乳酸杆菌进行耐药谱及质粒谱层面的分析，评估人体肠道乳酸杆菌常见菌种的耐药性，为疾病的治疗提供新的思路，丰富临床用药的依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种 药敏试验质控标准菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213）由四川大学华西医院惠赠；乳酸杆菌标准株（嗜酸乳酸杆菌ATCC4356）V517）由四川大学公共卫生学院医检教研室保存；乳酸杆菌试验菌株、经鉴定的正常人肠道粪便分离株，共43株，由四川大学公共卫生学院医检教研室保存。

1.1.2 试剂

1.1.2.1 培养基及试剂 MRS液体/固体培养基（按照《保健食品与评价技术规范》自配）；改良MRS液体/固体培养基（在MRS液体培养基的基础上，磷酸氢二钾、柠檬酸三铵和硫酸镁含量减半，去掉吐温80和乙酸钠）；SDS-MRS液体培养基（在MRS液体培养基中加入0.015%的SDS）；5倍TBE溶液；质粒提取试剂盒，购于Omega公司。

1.1.2.2 抗生素标准品 八大类12种（见表1），购于中国药品生物制品检定所，参照文献配制[1]，抗生素原液浓度为1 280 μg/ml。苯唑西林纸片购于北京天坛药物生物技术开发公司。

1.1.2.3 糖标准品 扁桃甙、阿拉伯糖，纤维二糖，果糖，半乳糖，葡萄糖，葡萄糖酸盐，乳糖，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，松三糖，蜜二糖，棉子糖，鼠李糖，核糖，柳醇，山梨醇，蔗糖，海藻糖，木糖，七叶苷，共22种，购于北京路桥技术有限公司。参见文献配制糖发酵管[2-3]。

表1 43株乳酸杆菌耐药情况（株）

1.2 方法

1.2.1 糖发酵试验(微量法)将乳酸杆菌从肉汤转入MRS平板中，37℃微需氧培养24 h。将配制好的糖发酵试剂加入96孔板，200 μl/孔，用接种针从MRS平板上挑取适量的菌接种每孔中。37℃微需氧培养18～24 h后[3]观察结果。以嗜酸乳酸杆菌ATCC4356为质控菌，根据《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《中华人民共和国国家标准》的食品卫生微生物学检验标准判读结果。

1.2.2 药敏试验

1.2.2.1 微量肉汤稀释法[1]乳酸杆菌接种MRS肉汤，37℃微需氧增菌18～20 h。参照参考文献[5]进行试验。菌液浓度调至5×105cfu/ml，使用改良MRS培养基进行药敏试验。37℃微需氧培养18～24 h后，以标准菌株ATCC29213为质控，参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的非苛养菌常规药敏试验MIC结果的解释标准判读结果。

1.2.2.2 K-B纸片法[1，4]乳酸杆菌接种MRS肉汤，37°C微需氧增菌18～20 h。菌液浓度调至5×105cfu/ml，使用改良MRS平板及苯唑西林药片[5]。37℃微需氧培养18～24 h后，以标准株ATCC25923作为质控菌株，参考CLSI推荐的非苛养菌常规药敏抑菌环直径标准判读结果。

1.2.3 质粒测定

1.2.3.1 质粒的提取 乳酸杆菌接种MRS肉汤，37℃220 r/min微需氧振荡培养16～18 h。取5 ml菌液，高速离心后，弃上清液，加入25 mg溶菌酶，用缓冲液重悬菌体并使其与酶混匀，37℃水浴1 h。余下操作参照质粒提取试剂盒说明书。

1.2.3.2 质粒的测定 取10 μl质粒提取物加入制好的0.5%琼脂糖凝胶板中，7.5 V/cm电泳2 h，用UVI凝胶成像系统观察结果。以质粒标准菌株E.coli V517的质粒提取物为参考，判定质粒大小。

1.3 统计学方法 采用秩和检验对资料进行统计分析。

2 结 果

2.1 菌种鉴定 经37℃微需氧培养，质控菌ATCC4356糖发酵结果与嗜酸乳酸杆菌结果符合。在所测43株试验菌中共检出6个菌种，含量最多的为植物乳酸杆菌L.plantarum(n=21，51.17%)，其次是干酪乳酸杆菌L.casei(n=9，20.93%)、嗜酸乳酸杆菌L.acidophilus(n=7，16.28%)和唾液乳酸杆菌L.salivarius(n=3，6.98%)，同时还检出目前正常人肠道乳酸杆菌中尚未报道的乳酸乳杆菌L.lactis(n=2，4.65%)，赖氏乳酸杆菌L.leichmannii(n=1，2.32%)。

2.2 耐药情况 L.casei、L.plantarum、L.salivarius和L.acidophilus是人体肠道内常见的菌种。本文对被鉴定为上述四种菌种的乳酸杆菌进行了药敏分析，共43株，其耐药情况见表1、表2。经统计学秩和检验，四种菌对庆大霉素（χ2=8.773，P＜0.05）、四环素（χ2=14.659，P＜0.05）、头孢呋辛(χ2=11.262，P＜0.05）、头孢唑啉(χ2=13.810，P＜0.05）、利福平(χ2=12.030，P＜0.05）、罗红霉素(χ2=12.727，P＜0.05）及红霉素(χ2=17.886，P＜0.05)的耐药性差异有统计学意义。对环丙沙星(χ2=0，P＞0.05）、左氟沙星(χ2=0，P＞0.05）、万古霉素（χ2=0，P＞0.05）、青霉素(χ2=0，P＞0.05）、氨苄西林(χ2=0，P＞0.05)及苯唑西林(χ2=4.895，P＞0.05)的耐药性差异无统计学意义。

2.2 质粒检出情况 43株乳酸杆菌中有40株检出质粒，检出率为93%。其余菌株带有1～6个质粒，检出率分别为4.65%、32.56%、20.93%、4.65%、13.95%、16.26%。共检出20种不同大小的质粒，其分子量范围为1.9～85 kb，而大多数质粒小于20 kb，具体检出情况见表3。常见的质粒分子量大小是54.0 kb、41.0 kb、22.0 kb和 5.8 kb，检出率分别为60.5%、37.2%、37.2%、48.8%。经统计学秩和检验推断，不同乳酸杆菌种的质粒谱的差异无统计学意义(χ2=4.277，P＞0.05)。

表2 43株乳酸杆菌药敏纸片法结果（株）

表3 乳酸杆菌质粒检出情况

3 讨 论

3.1 菌种 根据伯杰氏细菌鉴定手册以及其他相关报道可知，乳酸乳杆菌存在于牛奶、干酪和用于制造干酪的引子中，而赖氏乳酸杆菌多存在于压缩酵母、谷物麦芽汁中[5]，二者并不属于正常人肠道内常见的菌种。这是否由于纳入对象在受试前食用了含有乳酸乳杆菌和赖氏乳酸杆菌的食品所造成的，还需进一步进行确定。

3.2 种间的耐药分析 本文旨在探寻乳酸杆菌种间水平的耐药谱及质粒谱的研究，为最终乳酸杆菌耐药性判读标准的制定提供数据。由于目前未见关于乳酸杆菌药敏结果判读标准，本实验参考的是CLSI推荐的非苛养菌常规药敏标准，从表型水平、质粒水平以及菌种水平去分析乳酸杆菌的耐药性，丰富了关于乳杆菌耐药性的实验数据。目前，从菌种水平去研究乳酸杆菌耐药性的主要菌种都来自于食品、动物及微生物制剂。Maria Rosaria D'Aimmo等[16]对从奶制品等中分离出的6株L.acidophilus及6株L.casei进行药敏试验，发现乳杆菌的两个菌种对氨苄西林、红霉素、青霉素、利福平都是敏感的，而对头孢噻酚、氯霉素、庆大霉素、四环素、万古霉素的耐药性与菌种相关[16]。其中万古霉素的结果与本研究有所差异，这种差异可能是由于菌种来源不同所造成的，其他结果与本实验是一致的。在各种来自与食品及微生物制剂的L.plantarum耐药性的报道，发现其对与氯霉素（耐药率为3%）、氨苄西林（47.5%）、氯唑西林（80%）、青霉素（77.5%）、红霉素（16%）、四环素（100%）[6-10]存在着不同程度的耐药性。除红霉素与本实验结论一致外，青霉素、氨苄西林存在着较大的差异。Cauwerts等[11]对来自家禽鸡肠道的乳酸杆菌进行的种间水平的耐药分析，发现L.salivarius带有耐四环素(耐药率75%)的tet（M）基因，50%的菌株带有耐红霉素(耐药率 81%)的 erm(B)[12]。Marisa 等[13]曾专门针对 L.acidophilus进行耐药研究，发现其对于氨基糖苷类全耐受，对氨苄西林、氯霉素、利福平敏感、邻氯青霉素50%敏感，四环素、红霉素类基本耐受，对万古霉素大部分耐受。后来Milazzo等[14]的研究再次证实L.acidophilus对氨基糖苷类抗生素全耐受。本研究结果与这些文献相符，正常人肠道常见的四种菌种对万古霉素都是耐受的。所以万古霉素治疗金黄色葡萄球菌（MRSA）感染等疾病时，不影响乳酸杆菌菌群。然而，如果乳酸杆菌成为条件致病菌发生异位，万古霉素并不能成为抗菌药物的最后防线，这将对临床治疗带来巨大的挑战。

3.3 耐药质粒 据报道，大多数乳酸杆菌质粒均为隐蔽性质粒，其功能无法获知。本次实验中虽从大多数细菌检出质粒，但并没有得出质粒谱和耐药谱之间、质粒谱与菌种之间的确切联系。耐药谱相同的菌株可能携带有不同数量和大小的质粒，而质粒图谱相同的菌株耐药谱可能相差很大，这证实了乳酸杆菌的耐药性除与质粒相关外，还与细菌的表型、环境以及来源等有关。

本实验中检出乳酸杆菌含有21种不同大小的质粒，范围在1.9～83 kb之间,而大多数质粒小于20 kb。根据目前文献资料，Geert等[17]研究发现植物乳酸杆菌中分子量为14 kb的质粒与四环素的耐药性有关，而在本次研究中并未检测出14 kb的质粒，推断可能四环素的耐药与其他大小的质粒同样有关系。Wang等[15]研究发现乳酸杆菌质粒大小在1.2～150 kb之间，绝大多数质粒小于20.0 kb，且数量各异，本次研究与以上报道的结果相符。

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